Test ELISA per la malattia di Lyme

Test ELISA per la malattia di Lyme

Di Paolo Maccallini

Gli esami sierologici per la malattia di Lyme in Europa seguono un algoritmo a due passi: si esegue un primo test molto sensibile e poco specifico (generalmente un ELISA); se questo è negativo, si conclude che la sierologia è negativa, se è positivo o dubbio, si procede a un secondo test, più specifico, detto immunoblot o western blot (Stanek, G et al. 2011).

Un test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) consiste nella esposizione al siero del paziente degli antigeni contro i quali si vuole misurare la presenza di eventuali anticorpi (vedi figura). Se il siero presenta anticorpi contro quello specifico antigene, questi si legheranno agli antigeni, a loro volta fissati a una superficie, detta piatto. In un secondo momento vengono aggiunti anticorpi che si legano a IgM e/o a IgG umane. Questi anticorpi, detti secondari, portano con sé un enzima (da cui il nome del test) il quale reagisce all’aggiunta di un substrato con l’emissione di una radiazione luminosa nella parte alta dello spettro del visibile (∼500nm) la quale viene poi rilevata con specifiche apparecchiature. In genere l’enzima usato è il horseradish peroxidase (HRP) e il substrato è la β-galattosidasi (Thermo Scientific, catalogo).

ELISA
Rappresentazione schematica di un test ELISA indiretto (disegno di Paolo Maccallini).

Nel caso della malattia di Lyme, gli antigeni impiegati nel test ELISA sono proteine sonicate (estratte con l’uso di ultrasuoni) da esemplari interi di B. burgdorferi sl, a volte con aggiunta di flagellina o di BmpA (Aguero-Rosenfeld ME et al. 2005), per aumentare la sensibilità. Una scelta alternativa è costituita dal peptide VslE oppure dalla sua sesta regione invariabile, la proteina IR6 o C6 (vedi questo post). Il peptide C6 riproduce la sequenza della regione invariabile 6 di un ceppo di Borrelia garinii (Liang FT et al. 1999). Ma la sequenza  è comune a tutte le spirochete del complesso B. burgdorferi sl  (Liang FT et al. 1999) e dunque è un ottimo candidato allo sviluppo di test sierologici per questo gruppo di patogeni.

Proteine immunogeniche di B. burgdorferi

Proteine immunogeniche di B. burgdorferi

Di Paolo Maccallini

In tabella propongo una rassegna delle principali proteine di superficie di Borrelia burgdorferi sl note per indurre una risposta anticorpale negli esseri umani (proteine immunogeniche, come si dice). Per ciascuna di esse è riportato il peso in kDa (1Da=1/12 della massa del C-12), la sigla identificativa e una breve descrizione. Sulla destra si ha la sensibilità degli anticorpi IgM e IgG contro ciascuna di queste proteine, in vari stadi della malattia di Lyme.

Risposta immunitaria
Tabella.  Le principali proteine immunogeniche di Borrelia burgdorferi sl sono riportate in ordine crescente di peso. In grigio i dati relativi alla popolazione del Nord Amercica, gli altri dati sono sulla popolazione europea. Si noti la persistenza della risposta in IgM alla OspC nella fase tardiva della malattia.

 I dati per BmpA, BmpB e BmpD sono presi da (Bryksin AV et al, 2005). I dati per OspA e OspB sono presi da (Akin E et al. 1999)  (per la fase EM) e da (Chandra A et al 2011) (per la fase tardiva). Gli altri dati sono tatti da (Aguero-Rosenfeld ME et al 2005). I valori evidenziati in grigio sono relativi alla popolazione del Nord America, gli altri competono alla popolazione europea.

Parete 3
Figura. Parete cellulare di Borrelia burgdorferi sl. Da Medical Biology, di Milton S e Baron S (1996), con modifiche. Disegno di Paolo Maccallini.

 Nella figura ho rappresentato schematicamente la parete cellulare di B. burgdorferi. Si può apprezzare la collocazione delle proteine di superficie nel doppio strato fosfolipidico della membrana esterna (Milton, S; Kwang-Shin, K. Medical Microbiology, 1996). Ho inoltre riportato le principali misure degli elementi anatomici salienti. Si noti la collocazione dello strato peptidoglicano, fra i due doppi strati fosfolipidici. Lo strato peptidoglicano ha una importante funzione di sostegno meccanico della parete cellulare e la sua sintesi è ostacolata dagli antibiotici del gruppo dei betalattamici.

Evoluzione della malattia di Lyme

Evoluzione della malattia di Lyme

Di Paolo Maccallini

In questo diagramma ho cercato di sintetizzare le possibili manifestazioni cliniche della malattia di Lyme, nonché la risposta ai trattamenti antibiotici. Ho utilizzato innumerevoli fonti, tra cui le principali sono (Stanek G et al. 2011), (Mygland, Å et al 2010), (Trevisan G et al., Borreliosi di Lyme, in Dermatologia di Pippione M, 2015), (Aucott, JN et al. 2012), (CDC, Lyme disease case definition, 2011), (Steere, AC et al. 1987), ( Bujak DI et al. 1996), (IOM, 2015).

diagramma
Decorso della malattia di Lyme, dal morso del vettore alla sviluppo della post-treatment Lyme disease syndrome. CFS indica chronic fatigue syndrome, FM indica fibromialgia.

Il rettangolo in basso a destra individua un insieme di pazienti definito post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS). Per una introduzione alla PTLDS si rimanda a questo post, mentre per i possibili legami fra PTLDS e chronic fatigue syndrome (CFS) si rimanda a questo post.

Volume di Borrelia burgdorferi

Volume di Borrelia burgdorferi

“Non ho mai smesso di cercare il segreto della forma.”

Le Corbusier

E’ stato dimostrata in vitro la capacità della spirocheta Borrelia burgdorferi di penetrare e vivere all’interno di cellule umane di tipo endoteliale (Ma Y et al. 1991) e neuronale (Livengood JA et al. 2006) e questa prerogativa è stata chiamata in causa come possibile meccanismo alla base della evasione del sistema immunitario e di perpetuazione dei sintomi nei soggetti già trattati secondo le raccomandazioni ufficiali (Donta ST, 2012). E’ possibile che un requisito fondamentale per una sopravvivenza intracellulare sia un volume modesto.

Altra caratteristica interessante di Borrelia burgdorferi è la sua capacità di passare dal fenotipo a spirocheta a un fenotipo sferico con un volume molto maggiore (round body, RB), sia in vivo che in vitro (Miklossy J et al. 2008). Come si vede dalla tabella sottostante (Maccallini P, 2016), il passaggio da spirocheta a RB comporta un notevole aumento di volume con un contestuale crollo del rapporto superficie/volume. Una possibile giustificazione per questa drastica trasformazione potrebbe essere il tentativo da parte di B. burgdorferi di diminuire gli scambi con l’esterno e rallentare il metabolismo, in modo da acquisire una forma di refrattarietà ai trattamenti antibiotici.

volume

Ulteriori considerazioni e la derivazione matematica di questi dati, sono disponibili nella già citata fonte (Maccallini P, 2016). Il volume e la superficie del batterio nel suo fenotipo a spirocheta con svliluppo a sinusoide piana sono stati calcolati in base alle misure riportate nella figura seguente.

Lunghezza d'onda
Misure relative a una lunghezza d’onda del fenotipo con sviluppo a sinusoide piana del batterio B. burgdorferi sl. Disegno di Paolo Maccallini.

CFS nella Ehlers-Danlos syndrome (EDS), EDS nella CFS

CFS nella Ehlers-Danlos syndrome (EDS), EDS nella CFS

Di Paolo Maccallini

Il collagene è una proteina fibrosa che condiziona l’organizzazione e le caratteristiche meccaniche dei tessuti viventi. Nei vertebrati superiori risulta essere la proteina più abbondante, costituendo più di un terzo del contenuto totale di proteine, ed è uno dei principali costituenti di quel sofisticato telaio proteico che stabilisce i rapporti meccanici e di posizione fra le cellule, detto matrice extracellulare (extracellular matrix, ECM). Il collagene è presente in varie forme, tanto che ad ottobre 2006 già 26 tipi di collagene erano stati descritti (Either R, Introductory Biomechanics, 2007). L’illustrazione -tratta dalla fonte citata- riporta l’organizzazione a tripla elica delle proteine di collagene.

collagene

Difetti nei geni che codificano per il collagene sono stati associati a vari quadri clinici che -nel loro complesso- vengono raggruppati nella sindrome di Ehlers-Danlos (Ehlers-Danlos syndrome, EDS). La patologia fu battezzata così da Weber nel 1936, in onore dei due dermatologi  Ehlers e Danlos, i quali descrissero i primi casi, circa 30 anni prima (Bayers e Murray, 2013).

Recentemente è stato evidenziato come i sintomi più invalidanti sperimentati dai pazienti EDS siano la fatica cronica (Voermans NC, 2010) e il dolore cronico  (Voermans NC, 2010). Questo ha indotto un gruppo di ricerca di Roma (Castori e colleghi) a determinare la frequenza di un quadro clinico compatibile con la CFS in una variante di EDS, la forma ipermobile.

Tra le varie forme di EDS, quella più comune (1/10.000-15.000) è il tipo III, chiamata appunto tipo ipermobile (EDS hypermobility type, EDS-HT), condizione a cui ci si riferiva in passato con il nome di sindrome di ipermobilità articolare (joint hypermobility syndrome, JHS). Questa patologia ereditaria è caratterizzata da spiccata mobilità delle articolazioni, da sintomi muscolo-scheletrici, disautonomia e disturbi gastrointestinali (Grahame R, 2009).

Ebbene, secondo Castori e i colleghi della Università La Sapienza di Roma, l’82.6% (38/48) del gruppo EDS-HT esaminato, soddisfa i criteri Fukuda (Fukuda K, 1994) per la diagnosi di CFS (Castori M, 2011). In particolare gli autori concludono che:

  Lo studio dimostra che la maggior parte dei pazienti affetti da EDS-HT/JHS soddisfa i criteri diagnostici per la CFS, con incidenza simile fra maschi e femmine.

Sulla base di questi dati statistici, gli stessi Autori speculano che:

I pazienti EDS-HT/JHS potrebbero costituire un sottogruppo significativo e sotto stimato di pazienti CFS.

In particolare gli Autori rilevano come questi pazienti costituiscano dei casi di CFS in cui, a fronte di scarsi segni di infiammazione (assenza di linfonodi doloranti e mal di gola cronici), si ha una predominanza di dolori muscolo-scheletrici e di manifestazioni di disautonomia (intolleranza ortostatica, tachicardia posturale ortostatica etc).

Sebbene la EDS-HT sia stata associata a mutazioni nel gene per la tenascina-X (Schalkwijk J, 2001) e nel gene COL3A1 (Narcisi P, 1994), attualmente non esiste un test genetico per questa forma di EDS, e la diagnosi rimane basata sui criteri clinici, come la scala di Brighton (Grahame R, 2000). In altri termini la EDS-HT/JHS è una diagnosi clinica, esattamente come la CFS, sebbene si abbiano forti sospetti che si tratti di una patologia genetica del collagene, o della matrice extracellulare in generale.

La associazione fra CFS e EDS era stata già evidenziata in un piccolo studio precedente (Rowe PC, 1999) i cui autori descrissero un gruppo di 12 pazienti con EDS e intolleranza ortostatica i quali soddisfavano i criteri diagnostici per la CFS. In questo caso 6 pazienti avevano una EDS-HT e i restanti un’altra variante della malattia, la EDS di tipo classico. Gli Autori conclusero che:

Tra i pazienti con CFS e intolleranza ortostatica, un sotto gruppo è affetto da EDS.

Fin qui dunque abbiamo visto che:

Non è chiaro però al momento (qualcuno eventualmente mi illumini) in che percentuale la EDS sia presente nella CFS. Vediamo ora come si possa giustificare la associazione fra queste due patologie. Nel seguito espongo alcune ipotesi personali.

  1. Una prima ipotesi è che la EDS e la CFS non abbiano nulla in comune, se non la clinica. Ovvero la EDS presenta -fra gli altri- sintomi che soddisfano i criteri per la CFS, ma è una condizione del tutto distinta. In questo caso tutti gli EDS con diagnosi di CFS sono stati mal diagnosticati e vanno collocati esclusivamente nella categoria EDS. La convergenza dei sintomi potrebbe essere giustificata dal fatto che nella CFS è possibile una disfunzione endoteliale sia nei grandi vasi che nel microcircolo (Newton D, 2011) e una disfunzione di questo tipo è presente anche nella EDS (Grahame R, 2009). Ma le cause sono differenti.
  2. La CFS potrebbe essere un tipo di EDS, cioè una forma particolare di malattia genetica del collagene, o della matrice cellulare in generale.
  3. La EDS-HT -per la quale non esiste ancora un marcatore genetico- potrebbe essere un danno al collagene indotto da fenomeni epigenetici, come ad esempio l’aggressione da parte del sistema immunitario, durante e/o dopo un insulto infettivo. E’ noto ad esempio che l’enzima elastasi prodotto dai neutrofili durante una infezione, sia in grado di danneggiare il tessuto polmonare (Manoranjan S, 2014). Il danno potrebbe essere dovuto anche direttamente ad agenti infettivi; sappiamo ad esempio che la spirocheta Borrelia burgdorferi è in grado di danneggiare il collagene (Müller K, 2012).
  4. La EDS potrebbe evolvere verso una malattia infiammatoria simil-CFS. Una possibilità infatti è che un collagene difettoso degeneri nel tempo, dando luogo a reazioni infiammatorie e autoimmuni, e dunque a una sindrome di tipo CFS. Questa ipotesi è suffragata dal recente riscontro di sintomi suggestivi di un disordine dei mastociti (mast cell activation syndrome, MCAS) in un insolito numero di pazienti con EDS-HT e disautonomia (Cheung I, 2015).

Studi ulteriori potranno forse risolvere presto questi quesiti. Nel frattempo sarebbe utile sotoporre i pazienti con diagnosi di CFS a visite presso centri specialistici per Ehlers Danlos, per i seguenti motivi:

  • i pazienti EDS possono giovarsi di ausilii e trattamenti che migliorano la qualità della vita, sebbene non ci siano cure specifihe;
  • i pazienti EDS devono essere sottoposti a controlli specifici, essendoci un maggiore rischio di patologie di tipo vascolare;
  • la EDS è riconosciuta e dà diritto a particolari benefici.

CFS nella malattia di Lyme, Lyme nella CFS

CFS nella malattia di Lyme, Lyme nella CFS

Di Paolo Maccallini

E’ stato riportato che circa il 18% dei soggetti con una ben verificata esposizione alla spirocheta Borrelia burgdorferi –i quali non siano mai stati sottoposti a trattamenti specifici per la malattia di Lyme- lamentano esclusivamente sintomi soggettivi quali fatica, mialgia e atralgia, senza mai manifestare i segni caratteristici della malattia di Lyme (eritema migrante, artrite, radiculopatia etc) (Steere AC, 1987). Questa popolazione è caratterizzata da:

  1. una ben definita serologia positiva per Borrelia burgdorferi;
  2. una clinica a volte sovrapponibile alla chronic fatigue syndrome (CFS) o alla fibromialgia (FM);
  3. nessun precedente trattamento antibiotico specifico per Lyme;
  4. una sigificativa quanto effimera risposta al trattamento antibiotico.

Per questo gruppo è stato proposto il nome di probable late lyme disease (PLLD) (Aucott JN, 2012). Tra i soggetti che hanno invece avuto una manifestazione classica della malattia di Lyme e che siano stati trattati con le terapie attualmente raccomandate, si riscontra a volte la permanenza di sintomi residui. In uno studio longitudinale su una popolazione di malati Lyme dell’isola di Nantucket (MA, USA), fu ad esempio rilevato che il 36% dei soggetti lamentava sintomi residui, consistenti prevalentemente in fatica, problemi di concentrazione e dolore muscolo-scheletrico (Shadick NA, 1999). In questo gruppo di pazienti è stata osservata una discreta frequenza di casi compatibili con diagnosi di CFS e FM. La condizione descritta prende il nome di post treatment Lyme disease syndrome (PTLDS). In uno studio su 23 pazienti con PTLDS -ad esempio- il 30% soddisfaceva i criteri diagnositici della FM e un 13% era compatibile con la diagnosi di CFS (Bujak DI, 1996). Il rischio di sviluppare la PTLDS sembra direttamente proporzionale al tempo intercorso fra l’inoculazione della spirocheta del complesso Borrelia burgdorferi sl, e il trattamento antibiotico (Kalish RA, 2001). Purtroppo è frequente che i soggetti PLLD abbiano benefici solo transitori dal trattamento antibiotico raccomandato; quindi questa popolazione, una volta individuata e trattata, finisce in parte nella categoria PTLDS (Aucott JN, 2012).

Questa premessa permette di concludere che tanto nella PLLD che nella PTLDS, esiste un sottogruppo di persone che soddisfa i criteri diagnostici per la CFS. Si può cioè affermare che la CFS può costituire una delle possibili manifestazioni cliniche della malattia di Lyme, esattamente come l’artrite o la paralisi di Bell. Per un approfondimento sui sintomi della CFS, e i vari criteri diagnostici usati per la diagnosi si rimanda ad un esaustivo articolo di Giada Da Ros.

Volendo esplorare la relazione tra Lyme e CFS da un punto di vista opposto, è legittimo chiedersi invece quanti siano i casi di Lyme all’interno del bacino di pazienti che soddisfano i criteri diagnostici per CFS. Ebbene, la recente revisione della letteratura scientifica sulla CFS, operata dall’Institute of Medicine, non riporta nessuno studio rilevante sulla frequenza della infezione da Borrelia burgdorferi sl  nella CFS, e si limita a sottolineare la somiglianza fra la CFS stessa e la PTLDS (IOM, 2015).  Tuttavia è possibile recuperare almeno due piccoli studi in cui non è stata dimostrata una particolare esposizione della popolazione CFS all’agente eziologico della malattia di Lyme (Pollark RJ, 1995) e (Mawle AC, 1995).

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The condition of M.E., argilla. Scultura di Paolo Maccallini.

Ora, poiché sappiamo che un gruppo consistente di pazienti CFS sviluppa la malattia dopo un episodio infettivo acuto, a prescindere dal tipo di infezione (Hickie, 2006), una possibile interpretazione di quanto fin qui esposto è che:

  • Borrelia burgdorferi sl sia solo uno dei possibili trigger infettivi (insieme all’EBV, a Coxiella burnetii etc) della patologia post infettiva che prende il nome di CFS.

D’altra parte i criteri stilati nel 1994 per la diagnosi della CFS non considerano una diagnosi di malattia di Lyme come criterio di esclusione, purché il paziente abbia ricevuto i trattamenti raccomandati (Fukuda K, 1994). Quindi pare che il comitato che stilò tali criteri sposasse questa ipotesi. Ipotesi che ha un suo fascino, soprattutto per la semplificazione che comporta nell’inquadramento di una patologia complessa come la CFS.

Esistono tuttavia alcune prove a sfavore di questa ipotesi, le quali suggeriscono che la PTLDS sia una entità seprata rispetto alla CFS. Infatti:

  1. i soggetti con PTLDS presentano una compromissione cognitiva mediamente maggiore rispetto agli altri pazienti CFS (Gaudino, 1997);
  2. i soggetti con PTLDS presentano un profilo immunitario non del tutto compatibilie con quello degli altri pazienti CFS (Shutzer, 2011), (Ajamian, 2015).

Quindi una seconda interpretazione dei dati disponibili potrebbe essere che:

  • la PTLDS sia una entità nosografica distinta dalle altre forme di CFS, anche quando la clinica appare simile.

Purtroppo questa questione rimane irrisolta e ulteriori studi sono necessari. Attualmente è in corso -presso la Stanford University- una indagine molto dettagliata su un gruppo di pazienti CFS con manifestazioni gravi, in cui è prevista anche la ricerca di antigeni di Borrelia burgdorferi con un metodo innovativo (vedi qui). E’ possibile che questa ricerca dia qualche indizio ulteriore. Nel frattempo potrebbe essere utile differenziare il sottogruppo CFS con serologia positiva per Borrelia burgdorferi e provare a trattare queste persone in modo differente. Questo approccio è suggerito dalle seguenti ragioni:

  1. il modello animale indica la possibilità che nei soggetti PTLDS ci sia una infezione attiva di basso grado da B. burgdorferi (Embers, 2012);
  2. esistono osservazioni cliniche a favore di cure antimicrobiche in soggetti CFS con accertata esposizione a particolari agenti infettivi (tra cui B. burgdorferi) (Batemen L et al. 2014);
  3. almeno due trial in doppio cieco dimostrano l’efficacia -nella riduzione della fatica- di cicli aggiuntivi di ceftriaxone nei soggetti con PTLDS  (Krupp, 2003), (Fallon, 2008).

Quindi, se da un lato è affascinante la prospettiva di trovare una spiegazione unificata per patologie come la CFS e la PTLDS, dall’altro è forse proficuo sezionare l’universo CFS, isolando particolari sottogruppi.

Borrelia mayonii

Borrelia mayonii

Una nuova specie patogena di borrelia è stata scoperta negli USA, in base alla identificazione di differenze nel gene oppA1. I pazienti in cui è stata trovata sono 6 su circa cento mila, e provengono esclusivamente dall’upper midwest (vedi figura). L’organismo -battezzato Borrelia mayonii (in onore del fondatore della prestigiosa organizzazione no-profit Mayo Clinic, William Mayo)- è stato rinvenuto anche in un esiguo numero di Ixodes scapularis, dalla stessa regione geografica (Pritt, 2016).

La cosa interessante è che, sebbene l’organismo produca gli stessi anticorpi che vengono rilevati dai comuni test sierologici, i sintomi che induce nell’uomo sono leggermente diversi da quelli di Borrelia burgdorferi, con presenza di nausea e mal di testa e con un tipo di rash cutaneo diverso da quello ‘a occhio di bue’. Si tratta di un rash diffuso, che dunque non viene riconosciuto dal medico come manifestazione della malattia di Lyme.

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Upper Midwest

Altra osservazione è che come negli Stiati Uniti, anche in Europa potrebbero esservi specie del tutto sconosciute di Borrelia, con sintomi non comunemente associati alla malattia di Lyme, che attendono di essere catturate dall’occhio scrupoloso della nuova generazione di ricercatori, nascoste negli intestini dei vettori, o nei gangli dorsali dei pazienti. In effetti, dalla mappa (vedi figura) si potrebbe pensare che gli antenati di questa borrelia siano venuti dal vecchio continente, magari in tempi più recenti rispetto alle altre specie, attraverso lo stretto di Bering. In questo caso potremmo avere anche noi questa specie, o una affine.

La dr.ssa Pritt ha rilasciato anche una intervista video su questa scoperta.