Il bicchiere mezzo pieno

Il bicchiere mezzo pieno

Il paziente zero

All’inizio di questo anno si è tenuta a San Francisco l’edizione 2016 della Personalized Medicine World Conference (PMWC) (programma). Durante la prima giornata dei lavori, il dr. Andreas Kogelnik, medico e bioingegnere presso l’Open medicine Institute, ha presentato alcuni dei dati relativi al metabolismo energetico di un giovane uomo affetto da ME/CFS, come esempio di applicazione delle nuove indagini metabolomiche in patologie difficili e ancora sconosciute. Il paziente in questione è il figlio di Ronald Davis, genetista presso la Stanford University attualmente impegnato nella ricerca sulla ME/CFS e sulla Lyme cronica, presso l’Open Medicine Foundation. E’ lo stesso Kogelnik a rivelare nel suo intervento l’identità dell’uomo di cui discute i dati metabolici, e d’altra parte le sfortunate vicende di questo ragazzo sono state rese pubbliche dalla sua stessa famiglia, anche allo scopo di incentivare la ricerca scientifica e l’investimento per la ME/CFS. Chi fosse interessato, trova un toccante racconto del progressivo declino intellettivo e fisico di Whitney (questo è il suo nome), in questo video e in quest’altro.

Un fotografo e la foto del suo metabolismo

Whitney, che ora ha approssimativamente 35 anni, da alcuni anni non è più in grado di spostarsi dal suo letto, di leggere, e di comunicare con i suoi genitori. In passato è stato un apprezzato fotografo e ha girato il mondo. Questo è il suo sito personale. L’ultimo aggiornamento (2013) dice: “Molto malato. Non posso parlare. Non posso scrivere abbastanza per comunicare. Non intrattengo una conversazione con qualcuno da sei mesi…” Whitney è un caso singolare, sia perché ha una manifestazione particolarmente grave di ME/CFS (ma ci sono altri pazienti come lui), sia perché suo padre è un professore di genetica presso una delle migliori università del mondo (Stanford University). E cosa può fare un papà-scienziato per salvare un figlio affetto da una condizione incurabile? Studia, certo! Ma non si limita a perlustrare compulsivamente le pubblicazioni scientifiche o i libri di biologia; mette in piedi un’intera squadra di ricercatori, cerca fondi per finanziarli, e inventa nuove tecnologie, per combattere la malattia. Nel video dell’intervento di Andreas Kogelnik possiamo vedere i primi risulatati del suo sforzo. In particolare al minuto 8 abbiamo una eloquente istantanea del metabolismo energetico di Whitney (vedi figura).

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Il livello di alcuni metaboiti della glicolisi e del ciclo di Krebs di Whitney, tratti dal video dell’intervento di Andreas Kogelnik, durante l’edizione 2016 della PMWC.

Joule e glucosio

Prima di esaminare i dati metabolici di Whitney, ricordo brevemente che il processo attraverso il quale le nostre cellule estraggono energia dai legami chimici del glucosio, consiste in due fasi. La prima, la glicolisi, avviene nel citoplasma (fuori dai mitocondri) e permette di ricavare due molecole di ATP da ogni molecola di glucosio. Lo scarto della glicolisi consiste in due molecole di piruvato, per ciascuna molecola di glucosio processata. Ma questo sottoprodotto è il carburante che alimenta la seconda fase, che si verifica all’interno dei mitocondri. In questa seconda fase, il piruvato è convertito in Acetil-CoA (con la sintesi di 3 molecole di ATP per ciascun piruvato), e l’Acetil-CoA è poi inviato al ciclo di Krebs (o ciclo dell’acido citrico), dove sono prodotte altre 12 molecole di ATP per ogni molecola di Acetil-CoA. Più precisamente, il ciclo di Krebs produce una molecola di ATP, tre di NADH e una di FADH2; queste due ultime molecole vengono inviate alla fosforilazione ossidativa (membrana dei mitocondri) dove vengono utilizzate per sintetizzare complessivamente 11 molecole di ATP. La conclusione è che una molecola di glucosio permette di produrre 2 molecole di ATP nel citoplasma, più 36 molecole all’interno dei mitocondri. Questi sono i rudimenti del bilancio energetico delle cellule. La questione si complica quando si considera che anche gli acidi grassi e alcuni amminoacidi sono utilizzati dai mitocondri per produrre energia.

Metà non basta

Cosa ci dice l’istantanea del metabolismo energetico di Whitney? Nel momento in cui si tiene conto del fatto che i dati sono stati normalizzati rispetto presumibilmente alla media aritmetica del controllo sano, emerge che il suo generatore funziona a circa metà della potenza media. Infatti, il piruvato (prodotto finale della glicolisi) è circa 0.6 del valore medio, e tutti i metaboliti del ciclo di Krebs sono compresi tra 0.4 e 0.7. Coerentemente, il livello di glucosio nel sangue è leggermente aumentato (il pancreas di Whitney riesce a evitare l’iperglicemia, evidentemente), mentre quello del lattato è altrettanto basso (il lattato è prodotto dal piruvato).  Ora, se il generatore cellulare di energia eroga una potenza (energia liberata per unità di tempo) pari al 50% di quello che normalmente l’organismo produce, ci si può aspettare che a soffrirne maggiormente siano gli organi con il più alto fabbisogno energetico, come il cervello e i muscoli. E questo modello teorico, basato sui dati reali della termodinamica di Whitney, spiegherebbe i suoi sintomi. Certamente altre interpretazioni sono possibili!

Fuori dal circolo di Krebs

Ma dove si trova il blocco del generatore cellulare del paziente zero? Se la glicolisi funziona al 50% e se è la glicolisi ad alimentare i mitocondri, la risposta sembra semplice: il blocco è nel citoplasma, cioè nella glicolisi stessa, fuori dai mitocondri. Questa interpretazione dei dati è coerente con quanto dimostrato da Christopher Armstrong e dai suoi colleghi della Università di Melbourne, nel 2015. Il gruppo di ricerca è stato infatti in grado di evidenziare un blocco della glicolisi, analizzando il normale pannello degli acidi organici nel sangue e nelle urine di 34 pazienti affetti da ME/CFS (Armstrong CW et al. 2015). L’ipotesi di un blocco della glicolisi è compatibile altresì con il recente lavoro europeo sui pazienti della reumatologia di Pisa, in cui è stata dimostrata una sovra espressione di due fondamentali enzimi mitocondriali (vedi questo post). Infatti, se i mitocondri vengono sottoposti a una riduzione dell’approvigionamento di carburante, è logico pensare che aumenteranno il numero di enzimi per estrarre ogni possibile joule dal substrato disponibile. La mia tuttavia è una semplificazione, infatti il ciclo di Krebs viene alimentato anche da carburante alternativo al piruvato, come alcuni amminoacidi e gli acidi grassi. Quindi il  ragionamento è riduttivo e non conclusivo.

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Whitney, da questa pagina.

Ipometabolismo come adattamento

Un’altra possibile spiegazione per la complessiva depressione del sistema energetico (fuori e dentro i mitocondri) è quella fornita da Robert Naviaux, nella sua recente pubblicazione sul metabolismo della ME/CFS. Secondo la sua visione, i mitocondri vengono parzialmente spenti, come risposta a una minaccia ambientale persistente (principalmente infezioni o sostanze tossiche); questa risposta è un meccanismo evolutivamente conservato, il cui ruolo è quello di proteggere l’organismo dalla minaccia, un po’ come la febbre è un sistema di difesa che favorisce la risposta immunitaria contro un virus o un battere. Se questo fosse vero, il blocco dei mitocondri dovrebbe essere gestito in concerto con un blocco della glicolisi, altrimenti si avrebbe l’accumolo di sostanze tossiche, come il lattato. Anche questa ipotesi si adatta bene ai dati sperimentali relativi a Whitney.

Conclusione

Il metabolismo del paziente zero, ovvero del primo paziente ME/CFS soggetto a una approfondita analisi metabolica secondo le nuove tecnologie disponibili, rivela un complessivo dimezzamento della potenza erogata dai generatori di energia delle sue cellule. Apparentemente il difetto è nella parte iniziale del metabolismo del glucosio, fuori dai mitocondri, e si riverbera ovviamente sul metabolismo mitocondriale, che risulta depresso. Tuttavia altre interpretazioni di questi dati sono possibili, come quella dell’ipometabolismo proposta da Naviaux e colleghi. Inoltre, sebbene una riduzione della energia del 50% sembrerebbe spiegare i sintomi, non è possibile affermare che questa riduzione sia la causa della patologia, piuttosto che una sua semplice conseguenza.

Mitocondri pisani

Mitocondri pisani

Una malattia, due gemelli, e tre enzimi

Un recente studio italo-inglese-tedesco (Ciregia F et al 2016) ha investigato il livello di enzimi mitocondrali in due gemelli, uno sano e uno affetto da ME/CFS. I mitocondri sono stati estratti dalle piastrine del sangue periferico dei due soggetti, quindi è stato misurato il livello di svariate proteine mitocondriali. Di queste, 194 sono risultate avere livelli significativamente diversi nei due individui, e in particolare la differenza più importante si è registrata in 41 di esse, con 34 sovra espresse e 7 sotto espresse nel gemello CFS rispetto a quello sano. I ricercatori si sono poi concentrati su tre dei 41 enzimi sovra espressi, e precisamente ACON, ATPB e MDHM.

Il test diagnostico

Dopo aver verificato che lo stesso risultato poteva ottenersi analizzando la saliva piuttosto che il sangue periferico, gli Autori hanno proceduto a misurare i livelli di questri tre enzimi nei campioni di saliva di 45 persone sane e di 45 pazienti ME/CFS, reclutati dalla Divisione di Reumatologia della Università di Pisa. L’analisi statistica su questi campioni ha confermato la sovra regolazione degli enzimi ACON e ATPB nei soggetti ME/CFS rispetto ai soggetti sani, ma non del terzo enzima. Questi due marcatori permettono di avere un test con una sensiblità dell’85%, e una specificità del 72%. Questo significa che su 100 soggetti con ME/CFS il test ne riconoscerebbe solo 85; su 100 soggetti sani verrebbe negativo in 72 e positivo nei restanti 28 casi.

Mitocondri che vogliono, ma non possono

Ma che funzione hanno questi due enzimi espressi in modo insolitamente alto? ATPB è la subunità beta dell’enzima ATP sintetasi, ovvero l’enzima che catalizza la reazione:

ADP + Pi + Energia → ATP

in cui una molecola di adenosina monofosfato è convertita in una molecola di adenosina trifosfato. Si trova nella membrana interna dei mitocondri e interviene alla fine della catena di trasporto degli elettroni. L’atro enzima (ACON) è l’aconitasi mitocondriale, e interviene nel ciclo di Krebs. Entrambi gli enzimi svolgono cioè funzioni essenziali alla produzione di energia, e una loro sovra regolazione potrebbe essere un tentativo dei mitocondri di sopperire a un funzionamento deficitario.

Energia e infiammazione

Gli Autori hanno potuto rilevare che il livello di ATPB era tanto più alto quanto più elevate erano le due citochine proinfiammatorie INF-gamma e TNF-alpha. La prima viene prodotta dalle cellule NK e stimola i macrofagi a presentare gli antigeni alle Th, oltre ad avere altre funzioni; la seconda è un fattore di attivazione di macrofagi, NK e cellule dendritiche, tra le altre proprietà. Entrambe svolgono un ruolo di ‘attivazione’ complessiva del sistema immunitario innato e adattativo e possono quindi considerarsi degli indici infiammatori sensu lato.

Conclusione

Questo lavoro europeo, partendo dallo studio della espressione degli enzimi dei mitocondri delle piastrine di due gemelli, uno malato e uno sano, propone due di queste proteine (ATPB e ACON) come test diagnostico per la ME/CFS. Inoltre dimostra che i mitocondri sovra esprimono questi due enzimi, in quello che sembra essere un tentativo (futile?) di potenziare una produzione di ATP deficitaria. Il livello dell’ATPB è inoltre tanto maggiore, quanto maggiore è l’infiammazione. Il fatto che l’anomalia sia stata riscontrata solo nel gemello malato suggerisce che la disfunzione mitocondriale non è di origine genetica. E’ acquisita, e verosimilmente legata a fenomeni infettivi e/o immunitari, come indica la correlazione tra ATPB e citochine pro-infiammatorie.

CFS e mitocondri

Questo studio sembra essere coerente con diversi altri che lo hanno preceduto, a cominciare dalla recente pubblicazione di Naviaux e colleghi. Per altri studi sul rapporto tra CFS e mitocondri si legga poi questo post.

Ossigeno-ozono terapia e CFS

Ossigeno-ozono terapia e CFS

Si è parlato recentemente di terapia con ozono (autoemotrasfusione) nella CFS. Vorrei allora condividere alcune riflessioni.

1) La terapia non può essere germicida, a differenza di quanto affermato da alcuni, in quanto – secondo la FDA – la concentrazione di ozono tale da esercitare effetto germicida dovrebbe essere molto superiore a quanto un paziente possa tollerare. Cito dal sito della FDA.

2) La terapia non è esente da effetti collaterali. Ci sono prove che induca fenomeni significativi di vasocostrizione e protrombotici, come rilevano gli autori di questo studio, apparso recentemente su Cardiology.

3) Un articolo del 2002 apparso sulla Rivista italiana di Ossigeno-Ozonoterapia afferma che la terapia si è dimostrata efficace in 4 su 5 pazienti fibromialgici e in 3 con ME/CFS (Borrelli E, Bucci V, 2002). La terapia è consistita in 2 autoemotrasfusioni settimanali (100 ml di sangue), con un massimo di 4 mg di ozono per ogni somministrazione. I pazienti ME/CFS hanno riscontrato la riduzione dei sintomi dopo 3 mesi di terapia continuativa e a 6 mesi dall’inizio della terapia erano guariti. Contemporanemente si somministrava vitamina C, N-acetil-cisteina, vitamina E, selenio e acido alfa lipoico, su base quotidiana. Lo studio non è in doppio cieco e si basa su un numero limitato di casi. Quindi questi dati sono di valore molto modesto.

4) L’idea che la procedura possa avere un qualche ruolo nel migliorare la produzione di energia del soggetto, fornendo ossigeno ai mitocondri, apparirà improbabile non appena si riflette sul fatto che un essere umano consuma circa 300 ml di ossigeno al minuto, e il gas infuso nel paziente durante la procedura ha un volume di 100-150 ml. Pur considerando che tale gas contiene anche ozono (quindi ossigeno triatomico) e che la sua pressione può essere maggiore di quella atmosferica, appare comunque evidente che tutto l’ossigeno infuso sarà bruciato nell’arco di alcune decine di secondi dal metabolismo del paziente.

Conclusione. La terapia non è stata ancora dimostrata efficace nella CFS, non è germicida, non fornisce un apporto significativo di ossigeno alle cellule e presenta effetti collaterali. Questo però non significa che non possa rivelarsi efficace, dopo studi più approfonditi, per motivi che ora non conosciamo. E’ bene che il paziente sia informato di questo, in modo da fare le sue valutazioni.

Ringraziamenti. Ringrazio Gualtiero Zucconi per aver recuperato sul web lo studio di Borrelli e Bucci.

Ottawa Lyme Conference 2016

Ottawa Lyme Conference 2016

Chi fosse interessato, trova in questa playlist i video della conferenza tenutasi in Ottawa il maggio scorso, organizzata dalla associazione Lyme canadese. Sono intervenuti molti importanti esponenti della ricerca sulla malattia di Lyme, tra cui Fallon (Columbia University), Dattwyler (New York Medical College) e Zhang (John Hopkins University). I video sono disponibili anche nella playlist di CanLyme. Nella mia playlist sono disposti in ordine cronologico.

Si tratta di molte ore di registrazione. I video 8, 10, 12, e 23 mi sono sembrati particolarmente edificanti.

Terapia psicologica ed esercizio sono senza utilità nella CFS

Terapia psicologica ed esercizio sono senza utilità nella CFS

Vecchi de dati e nuova analisi

L’esercizio graduale (GET), la terapia cognitivo-comportamentale (CBT), e la gestione delle energie (APT) non sono più efficaci del trattamento medico generico (SMC), nella CFS. Una rianalisi statistica dei dati di uno studio pubblicato sul Lancet nel 2011 (White, PD et al 2011), ha dimostrato che le quattro strategie elencate sopra sono equiparabili fra loro, cioè sono ugualmente inefficaci nella CFS (Matthees, A et al. 2016).

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Da (Matthees, A et al. 2016). Sebbene il grafico suggerisca che la CBT sia meglio della GET, e che entrambe siano meglio della SMC, queste differenze non sono statisticamente significative, come spiega l’articolo citato. Ovvero queste minime differenze possono essere il risultato di fenomeni casuali.

Lo studio apparso su Lancet aveva invece forzato la statistica, facendo così emergere una maggiore efficacia della GET e della CBT sugli altri due approcci. Una ulteriore forzatura era stata effettuata nel 2013, quando una rielaborazione dei dati da parte dello stesso gruppo aveva addirittura indicato la GET e la CBT come terapie risolutive nella CFS (White, PD et al 2013). Questo ha condizionato negativamente la visione di molti medici, anche in gamba, su questa patologia. La nuova analisi è stata effettuata, tra gli altri, da Philip Stark (dipartimento di statistica della University of California) e da Bruce Levin (dipartimento di biostatistica della Columbia University).

Il parere dell’Institute of Medicine

Nel 2015 L’institute of Medicine (IOM), un prestigioso organo scientifico statunitense, ha condotto una analisi approfondita delle migliaia di articoli scientifici prodotti negli ultimi decenni sulla ME/CFS. Questo lavoro ha prodotto un volume pieno di dati e di riferimenti bibliografici, disponibile gratuitamente on line (IOM, 2015). In merito alla CBT e alla GET, nel rapporto si legge (Appendix C): “I lavori di Taylor e Kielhofner (2005), coerentemente con le conclusioni della revisione sistematica di Ross e colleghi (2002, 2004), non hanno fornito alcuna prova per quanto riguarda l’efficacia riabilitativa  della CBT e/o della GET.  Differenze nelle metodologie, nelle misure dei risultati, nei criteri di selezione dei soggetti e altri fattori rendono difficle trarre conclusioni circa l’efficacia di questi interventi.”

Conclusioni

Questo non significa che si debba evitare ogni attività fisica, semplicemente ci si deve esercitare entro i propri limiti. La difficoltà è capire quali siano questi limiti, ma sicuramente il paziente riesce a individuarli meglio del medico. Non possono essere imposti dall’esterno, e l’idea che un allenamento progressivo possa migliorare il funzionamento di questi malati, è un mito medico privo di fondamento scientifico.

Cleavage of perforin within NK cells in ME/CFS

Cleavage of perforin within NK cells in ME/CFS

Paolo Maccallini

In questo studio porto dei dati a favore di un incremento dell’attività proteolitica all’interno delle NK, nei pazienti CFS. In particolare ipotizzo che la ridotta citotossicità delle NK sia dovuta alla digestione della perforina citoplasmatica, riconducibile a qualche enzima proteolitico, secondo una dinamica simile a quella descritta alcuni anni fa per l’Rnase-L.

Abstract
Rnase-L and perforin are two proteins involved in host defense against viral infections. In chronic fatigue syndrome (ME/CFS), a disabling pathology of unknown etiology, the pathway which leads to the activation of Rnase-L and the genetic expression of NK cells perforin have been reported to be both up-regulated. Moreover, while researchers have described the presence of truncated forms of Rnase-L in ME/CFS patients, another work documents a depleted intracellular perforin level in NK cells from ME/CFS subjects. In this paper, I propose the hypothesis that the same proteolytic activity is involved in both Rnase-L and NK perforin cleavage. This idea is based on the identification of a significant local alignment between their two primary structures, which involves sub sequences that are surface exposed in both tertiary structures. This peptide divides Rnase-L into two truncated forms, one of which with the same length as the one described in ME/CFS patients. Moreover, it represents a possible B cell epitope for human perforin and this might provide an explanation for the low level of intracellular perforin reported in NK cells from CFS patients, as discussed below.

Rnase-L

As a consequence of a viral threat, our own cells which are infected by pathogens start releasing INF-α, a cytokine which activates natural killer cells (NK), main actors of the innate immune system anti-viral response (Sompayrac, 2012). INF-α has other functions as well, and one of them is to promote the synthesis of the active form of Rnase-L, which is an enzyme implicated in the degradation of viral RNA (Bastide, et al., 2002). Rnase-L is a protein 741 amino acids long, with a mass of 83,533 kDa (ID: Q05823 ). It has been demonstrated that in ME/CFS a novel form of this molecule is present, with a weight of only 37 kDa, which is considered to be a dysfunctional variant of the 83 kDa peptide (Suhadolnik, et al., 1997). It accumulates in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) extracts from ME/CFS patients and has been considered a potential diagnostic marker (De Meirleir, et al., 2000). Some years later, an increased proteolytic activity in PBMC extracts from CFS patients, has been demonstrated to be responsible for the accumulation of the truncated form. More precisely, researchers found that proteases in CFS PBMC extract, as well as purified human leukocyte elastase, give rise to two fragments of Rnase-L, the one already found in previous studies and another one of 30kDa. The 37 kDa fragment includes the N-terminal end of the full size Rnase-L, while the 30 kDa fragment includes the catalytic site in the C-terminal part (Demettre, et al., 2002). Moreover, it was previously found that the whole pathway which leads to Rnase-L activation is up-regulated in ME/CFS patients with low molecular weight Rnase-L (Suhadolnik, et al., 1994).

 Perforin

 Perforin (ID: P14222 ) is an enzyme of 555 amino acids, with a weight of 61,7 kDa, used by NK cells and T CD8+ cells to induce apoptosis of infected cells, a process called cytotoxicity. More in detail, perforin forms pore-like structures to facilitate the entry of granzymes into the target cell, and granzymes activate several apoptosis pathways that ensure effective killing of the target cell (Sompayrac, 2012). It has long been recognized a cytotoxicity defect in NK cells from CFS patients, since first attempts in understanding the immunology of ME/CFS (Caligiuri, et al., 1987). It was subsequently possible to demonstrate that low cytotoxicity of NK cells from ME/CFS patients is associated with a low level of perforin within NK cells (Maher, et al., 2005). Surprisingly, a higher than normal perforin gene expression was found some years later, despite both the low NK cytotoxic activity and intracellular level of perforin in ME/CFS patients. In fact, in a 2011 study, the level of perforin mRNA was found to be elevated in NK cells from CFS patients (Brenu, et al., 2011).

The hypothesis

You would have noticed that both intracellular NK perforin and Rnase-L share the same pattern of a depleted level and an up-regulated pathway, in ME/CFS patients. In the case of Rnase-L, it has been possible, as mentioned, to further specify that low level of full length enzyme is due to the presence of a low molecular weight Rnase-L. I propose the hypothesis that perforin shares the same fate as Rnase-L of being digested by some proteases within NK cells, in ME/CFS patients. In order to legitimate this hypothesis, I am going to demonstrate the presence of a local similarity between primary structures of Rnase-L and perforin. I will show then that this shared peptide is a possible target for proteolytic activity as it is surface exposed in both these molecules. Moreover, I will provide a possible explanation for the finding of a low level of perforin in NK cells from MECFS patients.

In search for similarities between Rnase-L and perforin

Now, we will perform a local alignment between human perforin (ID: P14222 ) and Rnase-L (ID: Q05823 ) in search for some common peptides between the two primary structures through SIBI’s LALIGN (), using the following settings (default settings):

rnase-l-1

Remember that LALIGN uses a gap model op_gap + ex_gap(x), where x is the length of the gap; thus an opening gap of -12 with an extending gap of -2 corresponds to an opening gap of -14 with an extending gap of -2 in a gap model of the type op_gap + ex_gap(x-1). LALIGN gives us the following best alignment:

rnase-l-2

For settings in Eq. 1, LALIGN calculates a value of 0.1887 for λ, and of 0.02798 for K. Thus, according to local alignment statistic (Karlin, et al., 1990) we have that the number p of local alignments between two random sequences of 741 and 555 amino acids, with a score at least S, is

rnase-l-3

Consider now that the score  is calculated according to BLOSUM50, with a scale ln(2)/3. In order to calculate the score S to put in Eq. 2, we have to change the scale of the scoring matrix:

rnase-l-4

According to Eq. 2, the number p of local alignments with a score at least 61.22 is

rnase-l-5

A local alignment is usually considered to have good significance when it reaches a p of 0.05 (Altschul, 1991), nevertheless two times that threshold value could still be of interest.

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The 30kDa Rnase-L fragment

Demettre and colleagues were able to identify that the N-terminal end of the 30kDa Rnase-L fragment was 500-HLADFDKSI-508  in case of digestion by human elastase, and 492-LIDSKKAAH-500 when cleavage was obtained through PBMC extract from CFS patients (Demettre, et al., 2002). Interesting enough, in both cases we have a fragment which may be produced when the target of the proteolytic activity is the local alignment found for Rnase-L and perforin. A way to further verify this hypothesis is to see if the peptide found in the local alignment is surface exposed and thus available to proteolytic enzymes. Rnase-L structure has been experimentally determined by X-ray diffraction method, with a resolution of 2.31 Å (Han, et al., 2014). Its ID in the molecular modelling database (MMDB) is 118306, while its protein data bank (PDB) ID is 4OAU. You can find molecule’s 3D structure in this page (). I have downloaded its data in ASN.1 format and I have read it with Cn3D 4.3.1 () and then I have searched for the peptide of the local alignment indicated above (Table 1) and highlighted it in yellow. As you can see (Figure 1) this peptide is surface exposed in its central residues, even if it has not a good protrusion from the  molecule’s surface, on the contrary. Nevertheless, it may still be available for protelytic enzymes.

A possible explication for low perforin content

As mentioned, NK cells from CFS patients have a low perforin content (Maher, et al., 2005), associated to a high perforin gene expression (Brenu, et al., 2011). NK perforin content has been evaluated with the use of a phycoerythrin labeled anti-perforin antibody with an assay described in a previous study (Maher, et al., 2002). According to my hypothesis, perforin is digested with a cleavage between residues 329 and 353. If the epitope of the anti-perforin antibody used by Maher and colleagues to detect NK perforin included part of this peptide, the antibody would fail to detect perforin, even if truncated forms of this enzyme were present. Unfortunately, we don’t know the epitope of human perforin bound by the anti-perforin Ab used by Maher and colleagues. We thus predicted both linear and conformational B cells-epitopes by using Ellipro (Ponomarenko, et al., 2008), a free software which calculates the level of protrusion (protrusion index) of each residues from protein central ellipsoids of inertia which include a specified portion of the protein itself, according to Thornton’s algorithm (Thornton, et al., 1986). As the structure of human perforin has not been experimentally determined yet, we allowed Ellipro to predict a 3D model using as a template the experimental structure of murine perforin (), found in 2010 with X-ray method and a resolution of 2,75 Å (Law, et al., 2010). Through this analysis, we found several linear and conformation epitopes, with our peptide present in three of them. In particular, residues 329-335 are included in a big conformational epitope. This means that this peptide is both an available target for proteolytic enzymes and a possible epitope for an anti-perforin antibody. In Figure 2 you can appreciate the surface exposure of peptide 329-335 in a model built by ModBase using murine perforin () as a template. This model has been downloaded in .PDB format, then converted to ASN1 data, using VAST search () page and hence read with Cn3D 4.3.1.

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Conclusion

We have proposed the hypothesis that the low level of intracellular perforin in NK cells from ME/CFS patients is due to the same proteolytic activity which underlays cleavage of Rnase-L in this patients group. We have proposed a possible proteases target shared by Rnase-L and perforin and we have shown how this theory matches with available experimental data. As for the reasons of this increased proteolytic activity, we quote Demettre and colleagues, who noted that: “proteases play an important role in numerous physiological responses and, in particular, in inflammation and apoptosis” (Demettre, et al., 2002).

References

Altschul, SF. 1991. Amino acid substitution matrices from an information theoretic perspective. June 5, 1991, Vol. 219, 3, pp. 555-65.

Bastide, L, et al. 2002. Interferon and the 2-5A/Pathway. [book auth.] P Englebienne and K De Meirleir. Chronic fatigue syndrome, a biological approach. Boca Raton : CRC press, 2002, 1, pp. 1-3.

Brenu, EW, et al. 2011. Immunological abnormalities as potential biomarkers in Chronic Fatigue Syndrome/Myalgic Encephalomyelitis. J Transl Med. May 2011, Vol. 9, 81.

Caligiuri, M, et al. 1987. Phenotypic and functional deficiency of natural killer cells in patients with chronic fatigue syndrome. J Immunol. Nov 15, 1987, Vol. 139, 10, pp. 3306-13.

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Ponomarenko, J, et al. 2008. ElliPro: a new structure-based tool for the prediction of antibody epitopes. BMC Bioinformatics. Dec 2, 2008, Vol. 9, 514.

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Suhadolnik, RJ, et al. 1994. Changes in the 2-5A synthetase/RNase L antiviral pathway in a controlled clinical trial with poly(I)-poly(C12U) in chronic fatigue syndrome. In Vivo. . Jul-Aug 1994, Vol. 8, 4, pp. 599-604.

Thornton, JM, et al. 1986. Location of ‘continuous’ antigenic determinants in the protruding regions of proteins. EMBO J. . Feb 1986, Vol. 5, 2, pp. 409-13.

La nemesi e l’umbratile custode

La nemesi e l’umbratile custode

Tra le altre cose, mi è capitato di studiare un modello quantitativo per la riduzione del metabolismo di B. burgdorferi quando il battere è esposto a sostanze per lei tossiche, come la doxiciclina. Infatti è così che la spirocheta si difende e sopravvive alla doxiciclina: diminuisce il suo metabolismo (Sharma, B et al. 2015) e si gonfia, riducendo il rapporto superficie/volume di circa 6 volte (Maccallini, P).

Ebbene, ieri stavo riguardando la soluzione del sistema di equazioni che ho usato per descrivere la velocità del metabolismo di una colonia di spirochete, e ho capito. Quello che stavo osservando, tra il confuso e lo stupidamente compiaciuto, era il dauer di Naviaux, l’ipometabolismo dei mitocondri descritto da Robert Naviaux nel recente articolo sul metabolismo dei pazienti CFS! Più precisamente, avevo descritto l’ipometabolismo di B. burgdorferi, il dauer di questa spirocheta.

Quello che voglio dire è che il dauer viene dai batteri, è una loro strategia di sopravvivenza. I mitocondri, che furono batteri, lo hanno ereditato dalle pieghe oscure del Precambriano, da anonimi procarioti di cui la Terra ha perduto memoria da più di 3 miliardi di anni. Il dauer è vecchio come la vita stessa. E’ la sua nemesi, ma anche il suo umbratile custode.

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Duello (2003), matita e pastelli su carta, di Paolo Maccallini.

E’ una forza della natura, quel mostro che tante volte ho rappresentato nei miei disegni, col volto coperto da una faccia di teschio. Adesso è una formula, con esponenziali di matrici e tanti parametri da definire, sul monitor del mio computer. E forse non fa più così paura.

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Duello (2011), matita su carta, di Paolo Maccallini.