L’algoritmo di Needleman-Wunsch

L’algoritmo di Needleman-Wunsch

Allineamento di proteine

Cercare similitudini fra sequenze di peptidi è estremamente utile per stabilire rapporti evolutivi fra proteine (e quindi fra gli esseri viventi che le sintetizzano), per progettare vaccini, per studiare fenomeni di autoimmunità e altro. In questo post presento un software che si occupa proprio del confronto fra due sequenze proteiche. La scrittura di questo programma mi ha tenuto compagnia durante molti mesi, segnandomi la rotta fra le costanti ricadute e riacutizzazioni della mia malattia, malattia che fin’ora non mi ha ancora abbandonato per un solo giorno. Mentre scrivevo questo e altri codici, che ne sono lo sviluppo, inventavo anche un modo per aspettare il domani.

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Figura 1. Una sequenza di tre amminoacidi, con in evidenza il legame peptidico e l’angolo psi del legame fra il carbonio C-alpha e il C-beta di un amminoacido. Disegno di Paolo Maccallini.

Needleman e Wunsch

L’algoritmo di Needleman-Wunsch descrive un procedimento automatico che consente di calcolare il migliore allineamento possibile fra due sequenze di amminoacidi (Needleman SB, Wunsch CD, 1969). Questo metodo permette di svolgere in modo relativamente veloce e ingegnoso il confronto fra tutti gli allineamenti fra le due sequenze, considerando ogni possibile numero di lacune, in ogni possibile posizione. Il suo scopo è quello di scegliere fra questi allineamenti il migliore, ovvero quello che garantisce il ‘punteggio’ più alto, essendo tale punteggio calcolato utilizzando delle matrici quadrate di dimensione 20, dette ‘matrici di sostituzione’. Questo compito è non banale e comporta l’esame di un numero di allineamenti pari a

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dove k e m sono le lunghezze dei due peptidi. Si tratta di numeri molto elevati, infatti posto ad esempio k=4 e m=6, si ottengono circa 215 allineamenti diversi. In genere però si ha a che fare con peptidi di centinaia di amminoacidi, il che comporta milioni di possibili allineamenti tra cui cercare il migliore. Ebbene, l’algoritmo di Needleman e Wunsch permette di effettuare questa analisi senza dover considerare direttamente ogni allineamento possibile. In figura 2 e 3 si ha una descrizione grafica di questo algoritmo.

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Figura 2. L’algoritmo di Needleman-Wunsch, con l’indicazione delle variabili che ho usato nel mio codice per implementarlo. Disegno di Paolo Maccallini.
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Figura 3. La matrice TBM (trace back matrix) per uno specifico allineamento. Disegno di Paolo Maccallini.

Il mio programma

Il mio software per l’allineamento globale fra due proteine si chiama NeW_6 ed è scritto in Octave. Il programma presenta la stessa funzionalità di due analoghi prodotti di largo impiego, che sono LALIGN dello Swiss Institute of Bioniformatics e EMBOSS Needle dell’Europen Bioinformatic Institute. In particolare il mio programma ha le seguenti caratteristiche:

  • permette all’utente di scegliere fra un set di comuni matrici di sostituzione;
  • ha un modello di lacuna del tipo a+b(x), dove a è la penalità della lacuna iniziale, b quella delle lacune di estensione e x è il numero di lacune;
  • prevede lacune alla fine delle sequenze.

Lo sviluppo del programma, nonché il codice, si trovano in questo PDF, dove è possibile seguire vari esempi applicativi e varie versioni del programma stesso, nonché dei test in cui ne confronto l’output con i programmi attualmente in uso.

Applicazioni

Perché scrivere un programma che esiste già? Mi è servito per penetrare i metodi di allineamento fra due sequenze di amminoacidi, ma soprattutto mi ha permesso di costruire programmi più complessi (non inclusi nel PDF di cui sopra) che sto attualmente utilizzando per risolvere problemi di immunologia. In cerca di una soluzione.

Lyme a Roma

Lyme a Roma

La legge di Ginsberg

Volendo stimare il rischio di contrarre uno degli agenti patogeni trasmessi da Ixodes ricinus, si indichi con n il numero di morsi ricevuti da parte dell’Ixodes e con k la percentuale di zecche portatrici di quel particolare agente patogeno. Allora la probabilità p di contrarre il patogeno dopo n morsi è data dalla formula qui riportata (Ginsberg, 1993):

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Questo risultato si ricava immediatamente se si considera che la probabilità di essere morso da n zecche tutte non infette è pari a

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Dunque quella di essere morso da almeno una zecca infetta è appunto uno meno tale quantità.

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Tabella. Percentuale delle zecce portatrici di varie infezioni nella riserva naturale Insugherata (Mancini, et al. 2014).

Lyme a Roma

Volendo ora applicare questa formula in un contesto reale, consideriamo la riserva naturalistica dell’Insugherata, una vasta area verde che si estende nella zona nord di Roma, all’interno del Municipio XV. In tabella riporto alcuni dati statistici relativi alla popolazione di Ixodes ricinus di questa regione (Mancini, et al., 2014). Supponiamo ora che un abitante di Roma frequenti regolarmente in estate questa località, diciamo per 10 anni; supponiamo inoltre che questa persona ami fare escursioni, e per questo trascorra la maggior parte del suo tempo a contatto con la natura. Ammettiamo allora che sia complessivamente stato morso da tre Ixodes ricinus nel corso di questi 10 anni. La probabilità di essere stato morso da una zecca portatrice di uno qualunque degli agenti patogeni in tabella, è data da

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Ovvero si ha quasi la certezza che il nostro soggetto sia stato morso da un Ixodes infetto. Se consideriamo invece solo la probabilità di essere stato morso da una zecca portatrice di Borrelia, si ottiene

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Se ci chiediamo ancora che probabilità vi siano che si venga morsi da un Ixodes che sia portatore contemporaneamente -ad esempio- di Borrelia e di Rickettsia, si calcola facilmente che tale valore è dato da

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Rischio di trasmissione

Come si vede si tratta di probabilità molto significative. A questo punto tuttavia è necessario precisare che nel caso in cui si venga morsi da una zecca infetta e questa abbia modo di inoculare il suo carico patogeno, il nostro sistema immunitario non rimane indifferente e comincia ad aggredire l’invasore (Sompayrac, 2012). Ciò significa che solo una parte dei batteri inoculati sopravvive, ed è dunque in grado di dar luogo a una infezione sintomatica. In particolare, nel caso della Borrelia, si stima che, assunta una percentuale di I. ricinus infetti del 20 – 40%, allora la probabilità che il morso dia luogo a una borreliosi è solo del 1-2% (Trevisan, et al., 2015). Utilizzando questa stima, la probabilità p di contrarre il patogeno dopo n morsi e di sviluppare una infezione sintomatica diviene

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Applicando questa formula al caso del nostro esempio, abbiamo che la sua probabilità di contrarre una infezione sintomatica (e potenzialmente cronica) da Borrelia, scende drasticamente a 3%. Se estendiamo poi questo modello alle coinfezioni, la probabilità di contrarre una infezione sintomatica di uno qualunque degli agenti patogeni menzionati, nel presente esempio, è del 13%.

Bibliografia

Ginsberg, HS. 1993. Transmission risk of Lyme disease and implications for tick managment. American Journal of Epidemiology. 1 July 1993, Vol. 138, 1, p. 65-73.

Mancini, Fabiola, et al. 2014. Prevalence of tick-borne pathogens in an urban park in Rome, Italy. Annals of Agricoltural and Enviromental Medicine. 2014, Vol. 21, 4, p. 723-727.

Sompayrac, Lauren M. 2012. How the Immune System Works. Fourth Edition. s.l. : Wiley-Blackwell, 2012.

Trevisan, G, et al. 2015. Borreliosi di Lyme. [aut. libro] Mario Pippione. Dermatologia e malattie sessualmente trasmissibili. Terza edizione. Torino : Edizioni Minerva Medica, 2015, p. 113-119.

ME/CFS e il matrimonio dei due domini

ME/CFS e il matrimonio dei due domini

L’organo acquisito

Il tratto gastrointestinale umano ospita da 1 a 100 miliardi di batteri appartenenti a più di mille specie diverse. Se consideriamo questo ecosistema simbionte, che nel complesso prende il nome di microbiota intestinale, come un organo del corpo, allora dobbiamo ammettere che esso rappresenta il nostro più grande organo. Infatti solo il colon (vedi figura 1) ospita un numero di batteri pari a circa 9 volte il numero totale di cellule che costituiscono un essere umano (Egert M et al. 2006). Se si considera inoltre che ciascun battere intestinale ospita uno o più virus (Minot S et al 2011), si realizza come possa essere complesso e ricco, in termini di informazione genetica e di trascrizione proteica, il nostro ventre. Poiché alla nascita il tubo digerente è sterile, questo voluminoso organo viene costruito e poi modificato a partire dalla prima poppata del neonato (Morelli L 2008). Si tratta pertanto di un organo che acquisiamo e modifichiamo nel corso della nostra vita e che non dipende immediatamente dal patrimonio genetico. I batteri dell’intestino svolgono svariate funzioni, come la digestione di molecole non altrimenti assimilabili, la produzione di vitamina K, la protezione dalla proliferazione di agenti patogeni (Borody TJ et al. 2012), la regolazione del sistema immunitario intestinale e sistemico, la regolazione di disfunzioni comportamentali, come ansia e depressione (Frémont M et al. 2013).

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Figura 1. Il tratto digerente umano, con in evidenza il colon. Da WebMD.

Sei regni, due domini e un matrimonio

Per quello che segue, è utile ripassare velocemente la gerarchia dei gruppi in cui vengono classificati tutti gli esseri viventi, in base al loro legame evolutivo. La prima classificazione vede la distinzione in due grandi domini, quello delle cellule con nucleo (Eukarya), a cui apparteniamo noi stessi, e quello delle cellule senza nucleo (Monera, distinti da alcuni in Archea e Bacteria) a cui appartengono, tra gli altri, i batteri che popolano il nostro intestino (figura 2). In figura 3, la classificazione della nostra specie. E’ interessante notare che nel nostro intestino si assiste a una ricongiunzione (un matrimonio) fra due domini (Eukarya e Monera) separati da più di 2 miliardi di anni di evoluzione.

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Figura 2. I tre regni, da alcuni ridotti a due, con la unione di Archea e di Bacteria in Monera. Archea e Bacteria sono costituiti da organismi unicellulari sprovvisti di nucleo, e a queste categorie appartiene il microbiota intestinale. Il dominio Eukaryota (o Eukarya) comprende organismi uni e pluricellulari, nelle cui cellule si riconosce un nucleo separato da una sua membrana. Noi siamo Eukarya. Da questa pagina, con modifiche.
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Figura 2. Gli esseri umani (Homo sapiens) appartengono alla famiglia degli Hominidae (in passato molto numerosa, oggi costituita da sole 7 specie), inclusa nel Phylum dei Chordata (che comprende tutti gli altri mammiferi, insieme ai rettili, agli anfibi, agli uccelli e ai pesci), a sua volta contenuto nel regno Animalia, uno dei 6 regni insieme a Plantae, Fungi, Protista, Archea, Bacteria. Se escludiamo Archea e Bacteria (da alcuni riuniti in un unico regno, detto Monera), gli altri regni rappresentano organismi uni o pluri cellulari costituiti da cellule con nucleo (eucariote) e formano il grande dominio Eukarya. Da questa pagina.

Neuroscienze enteriche

In questi anni lo studio della interazione fra il cervello e l’intestino ha posto le fondamenta di una nuova disciplina, a cui ci si riferisce con il nome di Neuroscienze enteriche. Si ritiene che il ‘collquio’ tra la flora intestinale e il cervello avvenga attraverso il sistema immunitario (Sankowski R et al. 2015), per mezzo delle fibre nervose del nervo vago (Goehler LE et al. 2007), o grazie a sostanze sintetizzate dalla flora intestinale (Kowlgi NG et Chhabra L, 2015).

Intestino e comportamento. Ad esempio, è stato possibile dimostrare che la somministrazione di Lactobacillus casei (ceppo Shirota) migliora l’umore in soggetti con sintomi depressivi (Benton D et al. 2007), e riduce i sintomi ansiosi (ma non quelli depressivi) in persone con diagnosi di ME/CFS (Rao AV et al. 2009). La somministrazione di Bifidobacterium infantis invece ha dimostrato, nei topi, di poter aumentare il livello di triptofano nel plasma e di modulare i metaboliti della serotonina nella corteccia frontale e della dopamina nella amigdala (Desbonnet L et al 2008).

Intestino e funzioni cognitive. In caso di insulti al piccolo intestino (cioé il tratto compreso tra lo stomaco e il colon) è stata riportata uno stato di mal assorbimento dei carboidrati che raggiungono così il colon, non digeriti. In questo scenario lo smaltimento di queste molecole in una sede non naturale porta a un incremento di acidi organici, tra cui acido lattico e acidi grassi a catena corta, che abbassano il pH del colon. L’aumento di acidità porta a sua volta a una proliferazione di quei batteri responsabili proprio della sintesi acido lattico (gli enantiomeri L e D), principalmente Lactobacillus fermentum e L. acidophilus. Poiché il principale enzima in grado di metabolizzare il D-lattato (D-2-HDH) è inibito in ambiente acido, si ha un accumulo di D-lattato, che si riversa nel sangue e causa sintomi cognitivi, come perdita di coordinazione motoria e confusione mentale, fino al delirio (Kowlgi NG et Chhabra L, 2015). Anche la sovracrescita dei Bifidobacterium è stata associata a produzione anomala di acido lattico (Kaneko T et al 1997).

Flora intestinale nella ME/CFS

In quanto segue passo in rassegna alcuni dei principali studi sul legame fra la flora intestinale e la ME/CFS. Per contestualizzare, ricordo che nei soggetti sani il microbiota intestinale sembra essenzialmente costituito da batteri appartenenti a 7 Phyla, ovvero Bacteroides (45% del totale), Firmicutes (46%), Proteobacteria (3.6%), Verrucomicrobia (2.1%), Actinobacteria (1.6%), Tenericutes, e Euryarchaeota (Giloteaux, et al., 2016).

Lactobacilli canadesi. Un gruppo canadese (University of Toronto) ha sottoposto un campione di 35 pazienti ME/CFS (criteri canadesi) a un trial in doppio cieco, per verificare l’effetto terapeutico di 8 settiane di trattamento con Lactobacillus casei (famiglia delle Lactobacillaceae). In particolare, la terapia è consistita nell’assunzione per bocca di 8 miliardi di CFU (colony forming units) dopo ciascuno dei tre pasti principali, e di altrettante capsule vuote nel gruppo placebo. Lo studio prevedeva anche la misura di Bifidobacterium e Lactobacillus nelle feci dei soggetti, prima e dopo l’intervento. Complessivamente è stato registrato un aumento di entrambi i generi batterici nel gruppo trattato (vedi figura 4). L’aumento di Bifidobacterium è inaspettato, i  quanto non era somministrato nella terapia, ed evidentemente deve essere un effetto della assunzione di Lactobacillus. Dal punto di vista clinico, gli autori si sono concentrati sulla misura di ansia e depressione prima e dopo il trattamento, e hanno rilevato un miglioramento dell’aspetto ansioso, ma non dei sintomi depressivi (Rao AV et al. 2009).

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Figura 4. A seguito del trattamento con 24 miliardi di CFU di Lactobacillus casei si osserva un aumento sia del genere Lactobacillus che, inaspettatamente, del genere Bifidobacteria. Da (Rao AV et al. 2009).

L’interesse principale di questo studio consiste nell’aumento di Bifidobacterium indotto da somministrazione di Lactobacillus. Infatti, sebbene Lactobacillus non risulti carente nei pazienti del campione norvegese, Bifidobacterium risulta in difetto nello studio della Cornell University, oltre che in entrambi i pazienti portati come esempio. Sfortunatamente nello studio non è prevista la misurazione dei sintomi specifici della ME/CFS, quindi non sappiamo che impatto abbia il trattamento sulla patologia. L’ansia è un sintomo secondario, non fa parte dei criteri diagnostici e sicuramente non è presente in tutti i pazienti.

Remissioni? Nel 2012 Borody TJ e colleghi del Center for Digestive Diseases (CDD) (Australia) hanno riportato di uno studio su 60 pazienti ME/CFS (criteri Fukuda) trattati con batterioterapia. Gli autori hanno somministrato per infusione transcolonscopica una miscela di 13 batteri intestinali non patogeni, appartenenti al genere dei Bacteroides, alla Classe dei Clostridia (che include i Clostridiales e in particolare le Clostridiacee) e alla specie Escherichia coli (famiglia Enterobacteriacae, nel Phylum Proteobacteria). Dei 60 pazienti, 35 hanno avuto una risposta positiva. Dei restanti 25, dieci si sono sottoposti a un secondo ciclo di terapia; di questi, 7 hanno avuto beneficio. Complessivamente dunque 70% dei pazienti ha avuto un beneficio, mantenuto a 15-20 anni di distanza dalla terapia, nel 58% dei casi riesaminati (Borody TJ et al. 2012). Difficile commentare questi risultati, che lasciano increduli nel momento in cui si considera che i responsivi al trattamento avrebbero avuto una remissione, secondo gli autori. Inoltre manca un gruppo di controllo. Senza contare che tra i Bacteroides e le Clostridiacee (usati nelle infusioni) lo studio sui pazienti norvegesi (figura 6) ha riportato un eccesso, rendendo meno probabile (ma non impossibile) un effetto terapeutico di questi organismi nella ME/CFS.

Attenzione al D-lattato! Abbiamo visto come un problema di assorbimento nel piccolo intestino possa determinare un aumento di D-lattato nel sangue, con conseguenti deficit cognitivi. L’aumento dell’acido lattico è associato alla sovra cescita di Lactobacillus (Kowlgi NG et Chhabra L, 2015) e di Bifidbacterium (Kaneko T et al 1997). Nel 2009 De Meirleir e colleghi osservarono che anche i generi Enterococcus e Streptococcus possono essere potenzialmente implicati nella sintesi di D-lattato. Nella ME/CFS gli Autori furono in grado di dimostrare un eccesso di questi due generi nel microbiota dei pazienti, rispetto ai soggetti sani, e proposero l’ipotesi che i deficit cognitivi della ME/CFS possano essere dovuti almeno in parte a un eccesso di lattato nel sangue. Per suffragare ulteriormente questa ipotesi osservarono che i pazienti ME/CFS presentano notevoli similitudini con coloro che hanno alti livelli di D-lattato nel sangue (letargia, distubi cognitivi, fatica)  (Sheedy, JR et al 2009). In effetti i soggetti due e tre (figura 6) manifestano entrambi un eccesso di D-lattato nel sangue (dati non mostrati), associato a una anomala proliferazione di Streptococcus, ma non di Enterococcus, Lactobacillus, Bifidbacterium.

Probiotici svedesi. Nel 2009, 15 pazienti ME/CFS (criteri Fukuda) furono selezionati in Svezia per un trattamento sperimentale con Lactobacillus e Bifidobacterium. Il trattamento aveva una durata di 30 giorni e i pazienti venivano valutati due settimane prima dell’inizio, alla fine del trattamento, e un mese dopo la fine. Si somministrava una miscela di Lactobacillus paracasei F19, L. acidophilus NCFB 1748 e Bifidobacterium lactis Bb12 per un totale di 1 miliardo di CFU, due volte al giorno. Lo studio riportò un miglioramento nel funzionamento neurocognitivo nell’ultima osservazione, mentre nessun miglioramento fu riportato nella fatica e nella disabilità fisica (Sullivan, A et al. 2009). Si tenga conto che questo esperimento non ha previsto un gruppo placebo e si è basato su soli 15 soggetti.

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Figura 5. In blu i generi in eccesso nella ME/CFS rispetto al controllo sano, in arancio i generi in difetto (Giloteux L et al. 2016).

Disbiosi. Il primo studio sul collegamento fra disbiosi e ME/CFS fu un lavoro puramente speculativo apparso nel 2003 su Medical Hypotheses, in cui si presentava l’ipotesi che una riduzione in Bifidobacterium associata a una sovracrescita di batteri del piccolo intestino potessero produrre una disfunzione immunitaria in grado di generare i sintomi della ME/CFS (Logan AC et al. 2003). Nel 2009 De Meirleir partecipò a uno studio che dimostrò un eccesso di Enterococcus e Streptococcus e ipotizzò che una sintesi accresciuta di D-lattato da parte di questi batteri potesse causare aumentata permebilità delle pareti intestinali e i sintomi cognitivi associati a un incremento di D-lattato (sostanza tossica per il cervello). Inoltre, come abbiamo visto, la somministrazione di Lactobacillus e Bifidobacterium sembra migliorare le performance cognitive, ma non la disabilità fisica (Sullivan, A et al. 2009). In passato gli studi sulla flora intestinale erano limitati dal fatto che solo i batteri coltivabili potevano essere censiti; in seguito l’utilizzo di tecniche innovative di sequanziamento genetico di specifici geni (come il gene per l’RNA ribosomiale 16S) hanno permesso di avere una visione completa (o quasi) del microbiota, in condizioni di salute e malattia. Grazie a questa nuova tecnica, sempre De Meirleir eseguì il primo censimento della flora batterica intestinale in un gruppo norvegese di pazienti ME/CFS, che confrontò con una popolazione sana. L’analisi statistica rilevò un incremento dei generi Lactonifactor, Alistipes e una riduzione dei generi Holdemania, Syntrophococcus, Dialister e Roseburia (vedi figura 6), in un contesto di alta variabilità fra paziente e paziente (Frémont M et al. 2013). Il genere Roseburia contribuisce alla salute dell’epitelio del colon, alla produzione di energia, e alla protezione contro l’infiammazione dell’intestino. Queste funzioni sarebbero mediate dalla sintesi di butirrato (Louis P et Flynt HJ, 2009). Una riduzione di Dialister invisus è stata riportata nella malattia di Crohn (Joossens, M et al. 2011), quindi si potrebbe forse associare la complessiva riduzione del genere Dialister a patologie intestinali. L’aumento di Alistipes è stato riscontrato anche in persone affette da sindrome dell’intestino irritabile (IBS) con associato dolore addominale (Saulnier, DM et al. 2011). Poiché il genere Lactonifactor è coinvolto nella conversione di fitoestrogeni nelle forme attive (enterodiolo e enterolactone), è stato proposto che il riscontro di un aumento di questo genere nella ME/CFS possa portare a disordini nel percorso metabolico degli estrogeni e della vitamina D (infatti il recettore della vitamina D sembra interagire con i fitoestrogeni) (Frémont M et al. 2013).  Complessivamente dunque le alterazioni riscontrate nel campione norvegese di pazienti ME/CFS sembrano compatibili con un aumento della infiammazione intestinale. Nel 2016 un gruppo della Cornell University ha ripetuto una scansione del microbiota basata, come quella del 2013, sull’analisi del gene per l’RNA ribosomiale 16S. Al livello di Phyla si rilevano una ridotta abbondanza di Firmicutes (35% contro il 46%) e un aumento dei Protobacteria (8% contro il 3.6%). Le differenze a livello di genere sono riportate in figura 5 e figura 6 (Giloteaux L et al. 2016).  Si può vedere dalla figura 6 che non esistono concordanze tra il lavoro di Giloteux e quello di Frémont a livello di genere, se non per il Ruminococcus, carente in entrambi i casi. Nello studio più recente, ma non in quello del 2013, è stata msurata una riduzione di Faecalibacterium, un genere che -come il Roseburia– produce butirrato e quindi presenta proprietà anti-infiammatorie e protettive per l’intestino (Sartor RB et al. 2010). Sempre nel medesimo studio è stato possibile evidenziare una riduzione del genere Bifidobacterium, genere già dimostratosi di qualche beneficio come trattamento della ME/CFS (Sullivan, A et al. 2009). Complessivamente lo studio della Cornell University ha rilevato -per la prima volta- una ridotta biodiversità nel microbiota intestinale dei pazienti ME/CFS e una alterazione delle percentuali relative a livello di Phyla, di famiglie, e di generi (Giloteaux L et al. 2016).

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Figura 6. Studio del microbiota in un campione ME/CFS statunitense (Giloteux L et al. 2016) e in un campione norvegese (Férmont M et al. 2013), a confronto con i dati di due pazienti.

Traslocazione. Alterazioni immunitarie possono essere determinate dalla fuoriuscita (traslocazione) del microbiota dall’intestino, come è stato dimostrato nel caso della infezione da HIV (Vyboh K et al. 2015). Nella ME/CFS questo tipo di fenomeno è stato misurato per la prima volta da Maes e colleghi, i quali riportarono una insolita concentrazione sierica di IgA e IgM contro i lipopolisaccaridi (LPS) di alcuni batteri del microbiota intestinale (Pseudomonas aeruginosa, P. putida, Citobacter koseri, Klebisiella pneumoniae). La presenza di questa risposta delle cellule B non è altrettanto frequente nella popolazione sana e dimostra che il sistema immunitario dei pazienti ME/CFS entra regolarmente in contatto con batteri intestinali, la qual cosa è una prova di una traslocazione eccessiva (Maes M et al. 2007). Nove anni dopo un gruppo della Cornell University cercò una conferma della traslocazione del microbiota nella ME/CFS misurando, fra le altre cose, il livello di LPS e di CD14 solubile (sCD14) nel siero dei pazienti. Gli LPS sono essenzialmente di origine enterica, e il sCD14 è una sostanza prodotta di macrofagi come risposta agli LPS. Ebbene, questo gruppo ha dimostrato un incremento significativo di questi due parametri nei pazienti rispetto ai controlli sani (vedi figura 7), e ciò prova una eccessiva traslocazione (Giloteaux L et al. 2016).

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Figura 7. Il livello di LPS e di CD14 solubile nei pazienti ME/CFS è significativamente più alto che nei controlli sani, ad indicare una aumentata traslcazione della flra intestinale (Giloteux L et al. 2016).

Traslocazione e PEM. Ridotta permebilità intestinale e traslocazione batterica non sono prerogativa della ME/CFS, infatti sono state osservate anche in disturbi epatici (Zhu, et al., 2013), nella infezione da  HIV (Openshaw, 2009), e nella malattia di Crohn (Wyatt, et al., 1993). Questo rende difficile pensare che possa essere la causa dei sintomi più specifici della ME/CFS, come la post-exertional malaise (PEM). Eppure, nel 2015, fu possibile osservare per la prima volta un insolito aumento di batteri intestinali (Firmicutes) nel sangue periferico di pazienti ME/CFS, dopo esercizio. In figura 8 si può osservare come questo aumento sia spiccato, rispetto al controllo sano, dopo 48 ore dallo sforzo (pedalata con resistenza progressiva, fino all’erogazione di 25 Watt). Questa sorprendente osservazione ha indotto gli autori a ipotizzare che il riversamento di questo insolito numero di batteri intestinali nel sangue possa essere l’origine della crisi psico-fisica post-esercizio, che i pazienti chiamano crash, e che tecnicamente viene indicato con la sigla PEM (Sanjay KS et al. 2015). Questo risultato è di grande interesse e sicuramente merita ulteriori approfondimenti.

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Figura 8. Aumento dei batteri intestinali del Phylum Firmicutes a 48 ore da una prova da sforzo, nel sangue periferico (Shukla, SK et al. 2015).

Causa o effetto? E’ lecito chiedersi se la disbiosi sia un semplice fattore predisponente o aggravante della ME/CFS, se ne è addirittura la causa, o ancora se non è che una conseguenza di una sorgente più profonda del male, a cui non abbiamo ancora attinto. A tal proposito, Giloteaux e colleghi hanno proposto che la disbiosi intestinale possa fornire un contributo alla genesi di alcuni sintomi della ME/CFS (Giloteaux L et al. 2016), facendo però osservare che queste alterazioni non sono prerogativa della ME/CFS. De Meirleir e colleghi, hanno avanzato l’ipotesi che il frequente riscontro di infezioni intestinali nei pazienti ME/CFS -tanto da enterovirus (Chia JK et al. 2008) che da Parvovirus B19 (Frémont M et al. 2009)- possa generare una depressione della immunità specifica della mucosa, con una conseguente alterazione della flora intestinale (Frémont M et al. 2013). Recentemente, sempre De Meirleir, sembra aver definito meglio la sua ipotesi sull’effetto del sistema immunitario sulla composizione della flora intestinale, postulando che la ridotta attività delle cellule dendritiche della parete intestinale (cellule dendritiche plasmocitoidi, pDC) rilevata nei pazienti ME/CFS, sia la causa di una difettosa attivazione delle cellule B, cosa che causerebbe a sua volta una ridotta sintesi locale di IgA. Queste IgA tappezzano la parete intestinale dove regolano il microbiota, quindi una loro carenza potrebbe giustificare tanto lo sviluppo di disbiosi, che l’aumento della permeabilità dell’intestino (Lombardi VC et al. 2016). Come abbiamo visto sopra, la traslocazione del microbiota intestinale, sembra eccezionalmente accentuata dopo esercizio, e questo potrebbe avere un legame con il cash post-sforzo tipico della ME/CFS (Shukla, SK et al. 2015).

Un test per la ME/CFS. Utilizzando una combinazione di dati che includono la composizione della flora intestinale e la presenza di marcatori infiammatori, è stato proposto un test diagnostico per la ME/CFS con una sensibilità dell’81.7% e una specificità dell’85.5% (vedi figura 8) (Giloteaux L et al. 2016).

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Figura 8. Un test basato sulla combinazione di dati relativi alla composizione del microbiota e marcatori infiammatori riconosce la ME/CFS nell’81,7% dei casi.

Interventi alimentari. La ‘dieta occidentale’, con elevato contenuto di zuccheri e grassi, sembra favorire la crescita del Phylum dei Firmicutes e, in particolare, dei generi Clostridium, Eubacterium, Enterococcus; mentre appare nociva per lo sviluppo del Phylum Bacteroides. Il consumo di zuccheri raffinati media la crescita di specie opportunistiche quali Clostridium difficile e Clostridium perfringens, mentre i carboidrati complessi sembrano favorire il genere Bifidobacterium (Brown K et al. 2012). Se ne deduce banalmente che una preferenza per i carboidrati complessi a svantaggio degli zuccheri semplici, può migliorare la flora intestinale. E’ stato ipotizzato che una dieta ricca di polisaccaridi vegetali possa arricchire la flora intestinale di batteri appartenenti al Phylum Bacteroides, che è predominante in popolazioni africane che consumano questo tipo di alimenti (De Filippo et al. 2010). Una deficienza in vitamina D è stata associata ad anormalità nella flora intestinale (Mai V et al. 2009). In base alla ipotesi, sopra menzionata, di un difetto nella sintesi locale di IgA come causa di disbiosi e permeabilità intestinale, si potrebbe supporre un qualche ruolo terapeutico del colostro, composto per buona percentuale da IgA. Tuttavia questa ipotesi è tutta da dimostrare.

Paziente 1

Disbosi. L’eccesso del genere Lactinofactor potrebbe essere associato a una disregolazione del segnale legato ai recettori degli estrogeni e al recettore della vitamina D (Frémont M et al. 2013). L’eccesso del genere Eubacterium potrebbe essere corretto con una dieta più povera di grassi e di zuccheri (Brown K et al. 2012). L’eccesso del genere Streptococcus (5.8 con un riferimento di <5.0) può essere in parte responsabile dell’aumento del D-lattato in questo paziente (3.23 con riferimento di <1.66) (Sheedy, JR et al 2009). Il difetto severo di Bifidobacterium (0.06 con un riferimento di >5) potrebbe in parte spiegare le difficoltà cognitive di questo paziente e il basso livello di triptofano plasmatico (Desbonnet L et al 2008) ed essere un target per una integrazione mirata con probiotici dello stesso genere (Sullivan, A et al. 2009). Poiché il genere Lactobacillus si trova nella parte bassa della norma (0.09 con un riferimento di <1) è possibile altresì un intervento terapeutico con questo genere, che indirettamente aumenta il Bifidobacterium (Rao AV et al. 2009). Inoltre l’utilizzo di zuccheri complessi al posto di zuccheri semplici potrebbe ulteriormente favorire il Bifidobacterium a discapito dell’Eubacterium (Brown K et al. 2012).

Traslocazione. Questo paziente presenta titoli di IgA molto alti per LPS di specie enteriche, quali Pseudomonas aeruginosa, e meno elevati, per Citobacter koseri, Klebisiella pneumonia, Psudomonas putida. Questo suggerisce un livello significativo di traslocazione della flora intestinale attraverso le pareti dell’intestino stesso (Maes M et al. 2007). Tuttavia questa possibilità non sembra confermata dal livello di CD14 solubile, che è nella norma (Giloteaux L et al. 2016).

Terapia. Bifidobacterium (2 mld/die), Lactobacillus, dieta povera di grassi e zuccheri semplici. Colostro. Vitamina D.

Paziente 2

Disbosi. Il difetto del genere Roseburia (quasi assente) può contribuire alla permeabilità intestinale e alla infiammazione dell’intestino (Louis P et Flynt HJ, 2009). In questo caso potrebbe essere valutata una integrazione con butirrato, sostanza benefica prodotta da Roseburia. L’eccesso del genere Eubacterium potrebbe essere corretto con una dieta più povera di grassi e di zuccheri (Brown K et al. 2012). L’eccesso marcato del genere Streptococcus (16.23 con un riferimento di <5.0) può essere in parte responsabile dell’aumento del D-lattato in questo paziente (3.4 con riferimento di <1.66) (Sheedy, JR et al 2009). Il difetto di Dialister potrebbe essere legato a una cattiva salute dell’intestino (causa o effetto?) infatti è una prerogativa della malattia di Crohn (Joossens, M et al. 2011). Il difetto severo di Bifidobacterium (0.17 con un riferimento di >5) potrebbe in parte spiegare le difficoltà cognitive di questo paziente e il basso livello di triptofano plasmatico (Desbonnet L et al 2008) ed essere un target per una integrazione mirata con probiotici dello stesso genere (Sullivan, A et al. 2009). Poiché il genere Lactobacillus si trova nella parte alta della norma (0.64 con un riferimento di <1) è auspicable una certa moderazione nel consumo di probiotici contenenti questo genere (di solito associati a Bifidobacterium, nei prodotti che si trovano in commercio), infatti i Lactobacillus contribuiscono all’aumento del D-lattato sierico (Kaneko T et al 1997), che in questo soggetto è già elevato.  L’utilizzo di zuccheri complessi al posto di zuccheri semplici potrebbe ulteriormente favorire il Bifidobacterium a discapito dell’Eubacterium (Brown K et al. 2012).

Traslocazione. Questo paziente presenta titoli di IgA e IgM per LPS di Pseudomonas aeruginosa, e per nessuna altra specie enterica. E’ dubbio se questo riscontro sia attribuibile a una aumentata traslocazione della flora batterica (Maes M et al. 2007). Inoltre il livello di CD14 solubile è molto baso e questi indizi tendono a far escludere l’ipotesi di traslocazione del microbiota (Giloteaux L et al. 2016).

Terapia. Bifidobacterium (2 mld/die), evitare o moderare Lactobacillus, dieta povera di grassi e zuccheri semplici. Valutare integrazione di butirrato. Colostro. Vitamina D.

Un nuovo test per la malattia di Lyme

Un nuovo test per la malattia di Lyme

Introduzione

Nel 2015, uno studio della George Mason University (VA, USA) ha valutato la sensibilità e la specificità -nella malattia di Lyme- di un test che impiega delle particelle appositamente create per intrappolare le eventuali proteine OspA presenti nelle urine dei pazienti. I ricercatori hanno riportato una sensibilità e una specificità del 100% nella Lyme precoce localizzata (EM) e dei dati interessanti anche per la post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS), riesumando l’interesse per la ricerca diretta di antigeni specifici di B. burgdorferi sl nei fluidi biologici dei pazienti (1).

Cenni storici

Negli anni sono stati effettuati alcuni tentativi di rilevamento della proteina di superficie A (OspA) nel liquido cerebrospinale di pazienti con neuroborreliosi. In uno di questi, in particolare, si effettuò la misura dell’OspA nel liquor di 83 individui con vari sintomi neurologici, provenienti da un’area endemica per malattia di Lyme. La misura venne effettuata ‘catturando’ l’OspA per mezzo di un anticorpo antigene-specifico, attraverso il metodo descritto in Figura 1. Si rilevò la presenza della proteina nel 42% dei campioni, dei quali però solo il 57% era sieropositivo per B. burgdorferi sl (2). In un esperimento del 1989, un metodo analogo fu utilizzato per rilevare la presenza di OspA nell’urina di persone con una ben documentata malattia di Lyme. Su dieci pazienti analizzati, tutti sono risultati positivi all’esame, mentre nessuno dei dieci controlli sani dimostrò la presenza di OspA nelle urine (3). Nel complesso, l’affidabilità di questo genere di test è stata tuttavia ritenuta bassa (4).

Il nuovo test

Un test per la ricerca di OspA nelle urine dei pazienti Lyme deve superare tre difficoltà:

  1. la bassa concentrazione di questo antigene nelle urine;
  2. la possibile non specificità dell’anticorpo utilizzato per rilevare l’OspA nei campioni;
  3. la possibile inadeguata sensibilità dell’anticorpo per le OspA delle varie specie patogene di borrelia.

Il gruppo della George Mason University ha risolto il primo ostacolo progettando una particella di diametro nanometrico in gradi di sequestrare le eventuali molecole di OspA presenti nel campione di urine. In questo modo, all’interno della nano-particella si raggiungono concentrazioni elevate dell’antigene. Le altre due difficoltà hanno richiesto un esame approfondito del database di proteine attualmente conosciute, il quale ha portato a identificare la regione che va dall’amminoacido 219 al 253 di OspA, come una regione non omologa a nessun altra proteina di origine umana o di altri agenti infettivi. L’anticorpo utilizzato si lega a questo peptide, quindi riconosce solo l’OspA. Inoltre questo legame richiede la sequenza 236-239 di OspA, la quale è comune alle principali specie patogene di borrelia (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi ss, B. valaisian, B. spielmani, B. bissetti). Tutto questo dovrebbe garantire la specificità e la sensibilità del test.

Risultati

Ebbene, su 24 pazienti con eritema migrante, 24 sono risultati positivi al test; inoltre dei 117 controlli sani nessuno è risultato positivo. Questo depone per una specificità del 100% e per una sensibilità del 100% nella Lyme precoce localizzata. La presenza dell’OspA nelle urine scompare negli individui in cui il trattamento ha avuto successo, evidenziando anche la potenzialità del test di monitorare l’andamento della terapia. Gli autori si sono preoccupati infine di sottoporre all’esame 100 pazienti affetti da PTLDS, riscontrando l’antigene nel 41% dei pazienti, il che proverebbe una infezione attiva in questi soggetti (1).

E i falsi positivi?

Detto questo, è possibile muovere una critica dal punto di vista teorico per quanto riguarda la progettazione del test. Infatti gli Autori hanno identificato l’epitopo specifico dell’OspA solo sulla base delle sequenze di amminoacidi. Questo tipo di analisi non permette di sapere se esistono epitopi conformazionali simili su altre proteine. Pertanto possono esservi regioni di altre proteine rese simili alla sequenza 219-253 di OspA dal ripiegamento della catena peptidica (5). Questi antigeni saranno riconosciuti erroneamente come OspA dal test. Quindi si ha un rischio teorico di falsi positivi che richiede ulteriori approfondimenti.

ricera-ospa
Figura 1. Illustrazione del procedimento usato nei vecchi test per la ricerca diretta di antigeni nei liquidi biologici. Una piastra opportunamente preparata cattura le proteine contenute nel campione (urine o liquor). Quindi un anticorpo specifico per OspA viene aggiunto. In seguito un ulteriore anticorpo (detto secondario) specifico per la regione Fc delle IgG e coniugato a un enzima (in genere l’Horseradish peroxidase) viene inserito. Se l’OspaA è stato catturato sulla piastra, allora l’AC secondario si legherà all’anti-OspA. Un substrato viene quindi aggiunto, il quale emette una specifica radiazione luminosa se entra in contatto con l’enzima dell’anticorpo secondario. Disegno di Paolo Maccallini.

Conclusioni e prospettive

Attualmente i CDC non raccomandano questo test (6), è questo è più che ragionevole, visto che la sua validità è stata dimostrata in un solo studio. È tuttavia previsto il suo impiego nell’ambito di una ricerca sulla ME/CFS presso la Stanford University, affianco ai normali test sierologici per B. burgdorferi sl. Questo e altri studi consentiranno auspicabilmente di accertare se la procedura possa essere considerata o meno affidabile nella diagnostica della malattia di Lyme. L’ingegnere Alessandra Luchini, inventrice delle ‘nanotrappole’, ha raccontato in un incontro presso la George Mason University (7) (vedi sopra) il percorso di vita e di ricerca che ha portato alla messa a punto di questa metodologia e alla sua applicazione in altri ambiti, come quello oncologico.

Riferimenti

  1. Magni, R, et al. Application of Nanotrap technology for high sensitivity measurement of urinary outer surface protein A carboxyl-terminus domain in early stage Lyme borreliosis. Journal of translational medicine. November 2015, Vol. 13, 346.
  2. Coyle, PK, et al. Detection of Borrelia burgdorferi-specific antigen in antibody-negative cerebrospinal fluid in neurologic Lyme disease. Neurology. 1995, Vol. 45, 11.
  3. Hyde, F W, et al. Detection of antigens in urine of mice and humans infected with Borrelia burgdorferi, etiologic agent of Lyme disease. J Clin Microbiol. 1989, Vol. 27, 1.
  4. Aguero-Rosenfeld, ME, et al. Diagnosis of Lyme Borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. July 2005, Vol. 18, 3, p. 484–509.
  5. Morris, GE. Encyclopedia of life sciences. http://www.els.net. [Online] September 2007. [Riportato: 1 Aug 2016.] http://www.els.net/WileyCDA/ElsArticle/refId-a0002624.html.
  6. Centers for disease control and prevention. Laboratory tests that are not recommended. http://www.cdc.gov. [Online] Nov 2015. [Riportato: ]
  7. Luchini, A. Vision Series: Alessandra Luchini – “Nanotechnology in Biomedicine”. GMU-TV . [Online] April 2014.

Il gene del male

Il gene del male

I mastociti

I mastociti sono un tipo di leucociti appartenenti alla categoria dei granulociti (vedi figura 1). Nella fase non ancora matura li troviamo nel sangue, da cui si diffondono a tessuti diversi (pelle, mucosa, cervello, vie respiratorie) dove evolveranno verso il fenotipo maturo.

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Figura 1. I mastociti (in rosso) sono un tipo di granulocita, ovvero di globulo bianco (leucocita) del sistema immunitario innato. Disegno di Paolo Maccallini.

L’avvenuta maturazione dei mastociti si manifesta con l’espressione dei recettori FCεRI e HLA-DR. Il primo è legato alla più famosa funzione dei mastociti, ovvero qualla di degranulare in presenza di IgE specifiche per determinati antigeni (vedi figura 2); il secondo è legato a una funzione meno nota, che i mastociti condividono con gli altri granulociti, ovvero quella di presentare gli antigeni alle cellule T helper (Th). Il recettore FCεRI si lega alla regione costante delle IgE (regione Fc) e manda un segnale alla cellula affinché essa degranuli, rilasciando le sue potenti armi chimiche, in grado di distruggere la minaccia (parassita, battere o fungo). A questa funzione dei mastociti sono legati i fenomeni allergici e lo shock anafilattico.

mastociti
Figura 2. Attivazione dei mastociti mediata da IgE. Disegno di Paolo Maccallini.

Durante la degranulazione i mastociti liberano una grande quantità di molecole, con effetti molto diversi; ma queste molecole possono essere rilasciate in modo selettivo anche in assenza di degranulazione, in risposta a stimoli eterogenei. Un riassunto schematico delle funzioni di questi mediatori si trova in figura 3 (Warnesson S, Pejler G, 2014). Come si vede tale arsenale chimico interferisce con svariati sistemi, come quello circolatorio e quello nervoso, oltre che con altre componenti del sistema immunitario innato e con il collagene.

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Figura 3. Funzioni delle varie molecole rilasciate dai mastociti sotto stimoli diversi. La fonte di questa illustrazione è  (Warnesson S, Pejler G, 2014). Mi sono permesso di aggiungere in rosso la retroregolazione positiva che sia l’istamina quanto la triptasi hanno sui mastociti. Infatti entrambe le molecole posseggono recettori sui mastociti stessi, e la loro presenza contribuisce a indurre altri mastociti a rilasciare le stesse molecole.

La sindrome di attivazione mastocitaria (MCAS)

Da molti anni è nota una malattia proliferativa dei mastociti (mastocitosi) in cui un numero troppo alto di questi granulociti nei tessuti è direttamente proporzionale al livello della tripatsi nel sangue. Questa rara malattia ha una base genetica riconducibile a una mutazione del gene KIT (identificata con la sigla D816V), il quale codifica per una proteina di membrana dei mastociti detta transmembrane tyrosine kinase receptor o anche CD117 (Nagata H et al. 1995). In questa sede non ci interessa la mastocitosi, che è una condizione rara e tuttavia già ben caratterizzata in termini di diagnosi e trattamento. Ci interessa piuttosto una condizione, paventata per la prima volta nel 1991, in cui si ha un aumento del rilascio di mediatori specifici dei mastociti (non uno in particolare), senza proliferazione dei mastociti stessi (Roberts LJ, Oates JA, 1991). Il riscontro di evidenze sempre maggiori a favore della esistenza di una siffatta patologia, ha portato alla pubblicazione dei criteri diagnostici per questa condizione, denominata ‘sindrome di attivazione mastocitaria’ (mast cells activation syndrome, MCAS) (Akin C et al. 2010). La MCAS è caratterizzata da una sorprendente e soverchiante varietà di sintomi, tra cui alcuni soggettivi, come:

  • fatica;
  • deficit cognitivi;
  • alterazioni del comportamento (ansia, agitazione, attacchi di panico, depressione);

altri obiettivabili, come

  • ipermobilità articolare;
  • ipotensione, tachicardia;
  • rash cutanei, ulcere, follicoliti;
  • ridotta capacità di rimarginazione delle ferite con sanguinamento copioso;

e tanti altri (Afrin, LB in Mast Cells, 2013). Questa presentazione clinica lascia increduli in un primo momento, ma risulta perfettamente comprensibile nell’istante in cui si consideri la diffusione ubiquitaria dei mastociti e la varietà di tipo e funzioni dei mediatori da essi rilasciati (vedi ancora figura 3).

Marcatori biologici per la MCAS

I mediatori che possono essere misurati nel siero per supportare una diagnosi di MCAS sono elencati di seguito con la relativa sensibilità (Vysniauskaite, M et al 2015):

  1. eparina basale (41%);
  2. triptasi (10%);
  3. cromogranina A (12%);
  4. N-metilistamina (22%).

Di questi solo la triptasi e la cromogranina A (usata anche come marcatore tumorale) possono essere eseguiti in Italia. Ma come si vede, la sensibilità di questi due marcatori è modesta. Si ricorda che la sensibilità di un test è il numero di risultati positivi ottenuti in un campione di 100 persone che siano portatrici della malattia (Parikh, R  et al. 2008). Mediatori meno specifici dei mastociti sono IL-1, IL-6, IL-8, TNF-alpha, and VEGF, tra gli altri.

Terapie per la MCAS

La terapia dela MCAS si avvale dell’uso di antagonisti dei recettori H1 (desloratadina, cetirizina etc) e H2 dell’istamina (ranitidina, famotidina), di stabilizzatori dei mastociti (sodio cromoglicato, ketotifene), degradatori della istamina (vitamina C) e altro (Afrin L et al. 2016).

MCAS, POTS, EDS III

Nel 2015 un gruppo australiano pubblicò un articolo in cui si descriveva la presenza contemporanea di tre malattie relativamente rare, in un gruppo di 6 persone. Le patolgie riportate erano la MCAS, di cui abbiamo discusso sopra, la ipotensione posturale ortostatica (postural orthostatic tachycardia syndrome, POTS), e la sindrome di Ehlers Danlos (EDS) (Cheung I et al 2015).

standing-test
Figura 4. Lo standing test di un soggetto di sesso femminile caratterizzato da ipermobilità articolare e clinica compatibile con la ME/CFS. Si noti il progressivo aumento della frequenza cardiaca dopo il passaggio dalla posizione supina a quella eretta, nonché l’instabilità pressoria. Il primo aspetto configura una diagnosi di POTS, il secondo non è necessario alla diagnosi di POTS, ma rivela una incertezza del sistema pressorio forse legata alle anomalie meccaniche delle pareti dei vasi. Grafico e misure di Paolo Maccallini.

La POTS è un tipo di intolleranza all’ortostatismo (orthostatic intollerance, OI), definita dalla persistenza di sintomi di OI associati a un incremento di 30 pulsazioni al minuto o a una pulsazione maggiore di 120 b/m, dopo dieci minuti di postura eretta (vedi figura). Per la diagnosi di POTS non è richiesta la presenza di ipotensione ortostatica (un’altra forma di OI). I sintomi di OI si acuiscono quando si assume la posizione eretta e sono i seguenti: deficit cognitivi quali perdita di memoria, ridotta concentrazione e capacità di ragionamento (fino alla perdita di coscienza); difficoltà visive, vertigini, mal di testa, fatica, aumento o diminuzione pressoria, debolezza, nausea, dolore addominale, sudorazione anomala, tremori, e intolleranza allo sforzo. Questa sintomatologia migliora sdraiandosi. La EDS è una malattia caratterizzata da difetti nelle articolazioni e nelle pareti dei vasi, ricondotti in molti casi a specifici difetti nei geni che codificano per il collagene (Bayers e Murray, 2013). La forma più comune di EDS (1/10.000-15.000) è il tipo III, chiamata tipo ipermobile (EDS hypermobility type, EDS-HT), condizione a cui ci si riferiva in passato con il nome di sindrome di ipermobilità articolare (joint hypermobility syndrome, JHS). Questa patologia ereditaria è caratterizzata da spiccata mobilità delle articolazioni, da sintomi muscolo-scheletrici, disautonomia e disturbi gastrointestinali (Grahame R, 2009). Sebbene la EDS-HT sia stata associata a mutazioni nel gene per la tenascina-X (Schalkwijk J, 2001) e nel gene COL3A1 (Narcisi P, 1994), attualmente non esiste un test genetico per questa forma di EDS, e la diagnosi rimane basata sui criteri clinici, come la scala di Brighton (Grahame R, 2000).

Una origine ereditaria si è ipotizzata tanto per la MCAS (Molderings GJ et al. 2007) che per la EDS III (Grahame R, 2009), sebbene i tentativi di rintracciare i geni difettosi siano stati a lungo velleitari. La POTS sembra più relegata invece a una eziologia post-infettiva (Sandroni P et al. 2009) (Kanjwal K, et al. 2011) (Li H et al. 2014), ma anche in questo tipo di eziologie una predisposizione genetica non può essere esclusa. In ogni caso una concorrenza di queste tre patolgie in sei individui sembra un evento altamente improbabile, a meno che non si ammetta una origine comune delle tre condizioni.

Il gene del male

Partendo da questo presupposto, un gruppo di ricerca statunitense, guidato dal National Institute of Health (NIH), ha scansito il DNA dei componenti di 35 famiglie in cui erano presenti molti membri con una combinazione di manifestazioni cutaneee di tipo allergico, disautonoma, sintomi gastrointestinali, dolore cronico, ipermobilità articolare. Si noti che questo raggruppamento di sintomi è simile a quello descritto nel paragrafo precedente, ovvero è classificabile come MCAS+POTS+EDS III. Ebbene, i ricercatori hanno potuto dimostrare che molti di questi individui, ma non tutti, presentavano una elevazione della triptasi nel sangue. Non solo, ma questa anormalità è risultata legata a copie multiple (due o tre) del gene che codifica per la isoforma alpha della triptasi (gene TPSAB1). In particolare, coloro che avevano una tiplicazione del gene nello stesso allele erano coloro con triptasi più alta e con sintomi peggiori (Lyons JJ et al. 2016). Questo permette di identificare finalmente in modo obiettivo un gruppo di pazienti che fino ad oggi ha vagabondato da un medico all’altro, per anni, senza poter trovare una soluzione ai propri molteplici problemi di salute e a una condizione di disabilità cronica spesso annichilente e confusa con patologie psichiatriche (vedi queste testimonianze). In questo video divulgato dall’NIH all’inizio del 2016 si descrive la scoperta, quando ancora il gene non era stato identificato, mentre in questo video del 17 ottobre viene presentata la identificazione del difetto genetico. Tuttavia, come evidenziato in precedenza, una triptasi elevata si riscontra solo nel 10% dei casi di MCAS e questo fa pensare che solo i pazienti in cui la MCAS si associ alla POTS e alla ipermobilità articolare, ci si possa aspettare questo tipo di causa genetica. Per tutti gli altri soggetti sono necessari altri studi, senza escludere che possano aversi anche casi indotti da fattori ambientali (infezioni, esposizioni a sostanze tossiche, muffe etc).

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Figura 5. Nuovi criteri diagnostici per la ME/CFS proposti dal’institute of medicine (IOM) nel 2015 dopo una accurata revisione della letteratura disponibile (IOM, 2015).

E la ME/CFS?

I pazienti MCAS+POTS+EDS III potrebbero in alcuni casi essere stati classificati come ME/CFS. Infatti:

  • è stato riportata in almeno un’occasione l’occorrenza negli stessi pazienti di una clinica compatibile con ME/CFS, di intolleranza ortostatica (la POTS è un tipo di intolleranza ortostatica) e di EDS di tipo III (Rowe PC, 1999);
  • la presenza di intoleranza ortostatica è un criterio diagnostico per la ME/CFS (vedi figura 5) (IOM, 2015);
  • la EDS di tipo III soddisferebbe i criteri per la ME/CFS in un 80-90% dei casi secondo alcuni Autori (Castori M, 2011);
  • un possibile ruolo della MCAS nella ME/CFS è stato ipotizzato in almeno uno studio (Theoharides, TC et al. 2005);
  • è stato recentemente riportato un aumento del numero dei mastociti con fenotipo CD117+CD34+FCepsilonRI- (mastociti immaturi) nel siero dei pazienti ME/CFS, nonché una loro elevata propensione alla presentazione degli antigeni, con aumento della espressione del CD40 e del MHC-II (che dimostra uno stato di attivazione) (Nguyen T et al. 2016).

In base a tutto questo sembra possibile dedurre che un  sottogruppo di pazienti ME/CFS presenti la duplicazione o la triplicazione del gene per la triptasi alpha. Del resto la triptasi è un enzima proteolitico e un aumento di attività proteolitica è stato da tempo rilevato nella ME/CFS (Demettre, et al., 2002). Un semplice modo per capire se si appartiene a questo insieme di pazienti è testare la propria triptasi, cosa possibile in qualunque grande ospedale italiano. In caso di valore elevato ci si potrebbe forse rivolgere ai centri italiani per mastocitosi, i quali verosimilmente saranno i primi a offrire il test per le copie multiple del gene della triptasi alpha.

Conclusioni

Nel caso di individui con manifestazioni cutaneee di tipo allergico, POTS, sintomi gastrointestinali, dolore cronico, fatica cronica, deficit cognitivi, ipermobilità articolare è stata dimostrata una associazione con un elevato livello di triptasi nel sangue, dovuto a copie multiple del gene che codifica per una delle isoforme della triptasi. Questo gruppo di pazienti potrebbe in parte essere stato diagnosticato come ME/CFS, anche perché in alcuni casi è descritto l’esordio solo dopo eventi stressanti. Il livello di triptasi sierica può essere misurato in ogni grande ospedale italiano. Non è da escludre che le terapie attualmente usate per la MCAS siano di beneficio nei portatori del difetto genetico.

Approfondimenti

  1. In questo post introduco la MCAS, prendendo spunto da una conferenza di Lawrence Afrin.
  2. In questo post introduco la sindrome di Ehlers-Danlos e discuto i legami tra la EDS ipermobile e la ME/CFS.
  3. Rimando a questo post, per una introduzione a sintomi, diagnosi e trattamento della POTS.
  4. Propongo in questo post un ruolo causale dei mastociti nella post-exertional malaise.
  5. Propongo in questo post un ruolo causale dei mastociti nella insolita prevalenza di anticorpi anti-cardiolipina nella ME/CFS e nella malattia di Lyme.
  6. Propongo in questo post una ipotesi che lega l’aumento di attività proteolitica nella ME/CFS a uno squilibrio nella sintesi della perforina delle cellule natural killer.
  7. In questa playlist del mio canale youtube sono raccolti alcuni video sulla MCAS.

Mitocondri inglesi, il test ‘ATP profile’

Mitocondri inglesi, il test ‘ATP profile’

Introduzione

Il lavoro di Naviaux e colleghi della University of San Diego sull’ipometabolismo nella ME/CFS, ha fornito dati convincenti a favore di una riduzione del metabolismo energetico in questa patologia (Naviaux R et al. 2016). Una interpretazione analoga è stata suggerita sulla base di un diverso set di dati da uno studio precedente (Armstrong CW et al. 2015) e da uno successivo (Yamano E, et al. 2016), mentre arrivano conferme ufficiose di questa ipotesi da Olav Mella (Universitetet i Bergen, Norvegia) e da Maureen Hanson (Cornell University, USA). Infatti sia i norvegesi che la Cornell University hanno riferito di studi (non ancora pubblicati) che confermano l’ipometabolismo.

A volte ritornano, l’epopea dei neutrofili

In questo contesto mi sembra allora utile riesumare una serie di tre studi pubblicati tra il 2009 e il 2013 da un gruppo inglese costituito dal fisico Norman Booth, dal medico Sarah Myhill, e da McLaren-Howard (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012), (Myhill S et al. 2013). In questi lavori gli autori dimostrarono una complessiva depressione del metabolismo energetico dei neutrofili estratti dal sangue periferico di 71 pazienti con diagnosi di ME/CFS (criteri Fukuda) e presentarono un test, denominato ‘ATP profile’, in grado non solo di separare completamente i soggetti malati dai 53 controlli sani, ma anche di predire il livello di disabilità dei pazienti, espresso in termini di scala di Bell, un indice numerico sviluppato dal dr. David Bell. Gli esperimenti di Myhill e colleghi non sono stati mai replicati da un altro gruppo, e inoltre riguardano solo i neutrofili. Tuttavia oggi sappiamo, come detto, che tutte le cellule del corpo presentano un difetto energetico nella ME/CFS. Quindi sembra possibile che ciò che trovarono nei neutrofili sia un dato reale ed estendibile a tutte le cellule del corpo. Pertanto descrivo in quanto segue il test ‘ATP profile’ (che consta della misura di diversi parametri) e i risultati degli studi di Myhill e colleghi, alla luce delle nuove scoperte.

Il test ‘ATP profile’

Il test si basa sulla misura dell’ATP sia all’interno dei neutrofili che all’interno dei mitocondri dei neutrofili, in diverse condizioni sperimentali. I neutrofili furono estratti dal sangue periferico di 71 pazienti e 53 controlli sani nel primo esperimento (Myhill S et al. 2009). In un secondo lavoro, la misurazione fu effettuata su un secondo gruppo di 138 pazienti (cohort 2) mentre i dati del primo esperimento furono riesaminati, dopo aver escluso 10 pazienti con età non compresa tra i 18 e i 65 anni, ottenendo così un campione di 61 persone (cohort 1) (Booth, N et al 2012). La misura del contenuto di ATP si basa su una metodica sviluppata nell’immediato dopoguerra (McElroy WD, 1947). In quello che segue descrivo il test, così come è presentato nello studio del 2009, e discuto i risultati di un soggetto che si è sottoposto all’esame.

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Figura 1. La catena respiratoria (Cohen BH, Gold DR. 2001).

Contenuto di ATP nei neutrofili. Viene misurata la concentrazione di ATP in presenza di eccesso di magnesio (ATP^Mg_1) e viene espressa in nano moli per milione di neutrofili (Myhill S et al. 2009). Nel caso che portiamo come esempio si ha:

ATP^Mg_1 = 1.38 nmol/(10^6 cell.)          [1.6-2.9]

Oltre a questa misura di ATP, se ne effettua una seconda, senza aggiunta di magnesio. La indichiamo ATP e nel nostro esempio vale:

ATP = 0.84 nmol/(10^6 cell.)              [0.9-2.7]

Gli autori calcolano poi il rapporto tra la seconda e la prima misura (Myhill S et al. 2009). Nel nostro paziente abbiamo:

ATP/ATP^Mg_1 = 0.53              [>0.65]

Gli Autori rilevano che il controllo sano presenta un valore medio di questo rapporto di 0.686 con una deviazione standardi di 0.032, e suggeriscono che il basso valore di questo rapporto nei pazienti sia indice di una carenza di Mg intracellulare. Questa carenza ha conseguenze fisiologiche importanti poiché il Mg è un elemento essenziale affinché l’enzima ATPase svolga la sua funzione, che è quella di ricavare energia dalla degradazione di ATP in ADP  (Booth, N et al 2012).

Glicolisi. Si inibisce la catena respiratoria utilizzando azoturo di sodio, il quale blocca sia l’enzima ATP sintetasi (complesso V in figura 1) che il citocromo a3 (complesso IV in figura 1). A questo punto viene meno la respirazione e i neutrofili consumano rapidamente lle riserve di ATP. Dopo alcuni minuti viene misurato il contenuto di ATP dei neutrofili (Myhill S et al. 2009). Detto ATP^Mg_2 questo valore, nel nostro esempio si ha:

ATP^Mg_2 = 0.32 nmol/(10^6 cell.)          [<o.3]

Gli Autori osservano che nei neutrofili dei soggetti sani l’inibizione dlla catena respiratoria porta a un rapido crollo dell’ATP a un valore pari al 7.5% del valore iniziale, con una deviazione standard di 3.4%. Questo sembra coerente con la possibilità che il metabolismo dei neutrofili sotto l’effetto dell’azoturo di sodio sia sostenuto solo dalla glicolisi (Booth, N et al 2012). In effetti la glicolisi produce due molecole di ATP per molecola di glucosio, mentre il ciclo di Krebs accoppiato alla respirazione ne produce 36, di cui 2 in condizioni anaerobiche. Dunque con inibzione della respirazione si avrebbe una riduzione teorica della sintesi di ATP a 4/34, ovvero 12% circa di quanto prodotto in condizioni aerobiche. Quindi il parametro:

ATP_ini = (ATP^Mg_2/ATP^Mg_1)

si può considerare una misura del contributo della sintesi anaerobica di energia. Nel caso del nostro paziente si ha:

ATP_ini = 0.232            [0.04-0.11]

Come riferimento, in questo caso, ho usato la media più o meno una deviazione standard, piuttosto che i valori forniti nel referto.

Respirazione. L’azoturo di sodio viene rimosso e si misura nuovamente il contenuto di ATP nei neutrofili, dopo un intervallo di tempo assegnato (3 minuti). Questa misura fornisce il valore ATP^Mg_3 e gli Autori riportano che a inibizione rimossa, il livello di ATP nei neutrofili del controllo sano aumenta a un 60-90% del valore iniziale ATP^Mg_1. A questo punto introducono il rapporto:

OxPhos = (ATP^Mg_3-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1-ATP^Mg_2)

che propongono come una misura della efficienza della respirazione (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012). Nel nostro esempio si ha:

ATP^Mg_2 = 0.32 nmol/(10^6 cell.)          [<o.3]

ATP^Mg_3 = 0.87 nmol/(10^6 cell.)          [>1.4]

Si ottiene allora:

    OxPhos = (ATP^Mg_3-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1-ATP^Mg_2) = 0.519        [>60]

Purtroppo, a mio parere, OxPhos è piuttosto una misura della capacità della catena di trasporto degli elettroni di riprendersi dalla inibizione con azoturo di sodio, quindi una generica misura della salute della catena di trasporto. Come misura del contributo della ossidazione alla produzione di energia propongo invece il parametro:

ATP_oss = ( ATP^Mg_1-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1) = 1 – ATP_ini

Nel nostro caso si ha

ATP_oss = 0.768            [0.89-0.96]

Come riferimento, in questo caso, ho usato la media più o meno una deviazione standard, piuttosto che i valori forniti nel referto.

translocase.png
Figura 2. ADP/ATP translocasi (Bos taurus), da Protein Dat Bank, ID 10KC, con modifiche. In blu la superficie dlla membrana interna del mitocondrio (che si affaccia sulla matrice), in rosso la superficie che si affaccia sullo spazio compreso tra membrana mitocondriale interna e membrana mitocondriale esterna.

ADP/ATP translocasi. Questo enzima (riportato come ANT in figura 1) permette l’ingresso dell’ADP all’interno della matrice mitocondriale, dove viene convertito in ATP dall’enzima ATP sintetasi (complesso V in figura 1). ANT si estende tra la superficie esterna e la superficie interna della membrana interna dei mitocondri (figura 2). Presenta quattro isoforme negli esseri umani (ADT1, ADT2, ADT3, ADT4) probabilmente tessuto-specifiche. Il trasferimento di ADP e ATP è molto dispendioso e richiede il 25% della energia prodotta dalla respirazione (Kilngerberg M, 2008). Se l’enzima ANT non funziona correttamente, ne risulta una inibizione della catena di trasporto degli elettroni, del piruvato deifrogenasi (che converte il piruvato in Acetil-CoA), e di tutto il ciclo di Krebs (Pieczenik SR, Neustadt J, 2006).

Misura della efficienza di ADP/ATP translocasi. Durante l’esecuzione dell’ATP profile alcuni mitocondri vengono estratti dai neutrofili e il loro contenuto di ATP viene misurato. Detto ATPmito_1 questo valore, nel caso del nostro soggetto si ha:

ATPmito_1 = 225 pmol/(10^6 cell.)          [290-700]

dove ‘cell’ non si riferisce più ai neutrofili, ma ai mitocondri. Inoltre in questo caso la misura è in pico moli, cioè 10^(-12) moli. A questo punto un secondo campione di mitocondri è immerso in un bagno di ADP in modo da indurre l’enzima ANT a far entrare ADP nei mitocondri. Segue una nuova misura dell’ATP mitocondriale, che indichiamo ATPmito_2. Nel nostro esempio si è misurato il seguente valore:

ATPmito_2 = 290 pmol/(10^6 cell.)          [410-950]

Ci si aspetta un aumento di ATP perché l’ADP è uno degli ingredienti fondamentali per la sua sintesi. Nel nostro soggetto l’aumento è minimo, e questo viene interpretato dagli Autori come una scarsa capacità dell’enzima ANT di far entrare ADP nel mitocondrio. A questo punto il pH di una terza coltura di mtocondri è modificato (portato a 8.9 ± 0.2) in maniera da favorire la fuoriuscita di ATP dai mitocondri, sempre attraverso l’enzima ANT. Il contenuto di ATP dei mitocondri è quindi nuovamente misurato, fornendo il parametro ATPmito_3, che nel nostro soggetto è:

ATPmito_3 = 194 pmol/(10^6 cell.)          [140-330]

Da queste misure gli autori ricavano i seguenti due quozienti:

TL_out = (ATPmito_2-ATPmito_1)/ATPmito_1

TL_in = (ATPmito_3-ATPmito_1)/ATPmito_1

Il primo valore è proposto come una misura della efficienza di ANT nel traslocare ADP dal citoplasma a dentro i mitocondri; il secondo rapporto fornirebbe invece una misura della efficienza dello stesso enzima nel traslocare ATP dai mitocondri, dove è prodotto, al citoplasma (Myhill S et al. 2009).  Nel caso portato come esempio si ha

TL_out = 0.289        [>0.35]

TL_in = 0.138        [55-75]

Mitochondrial energy score. Gli autori hanno proposto un indice che riassume l’efficienza del sistema energetico dei mitocondri, chiamato Mitochondrial Energy Score (MES). Questo indice è stato definito in modo diverso nello studio del 2009 e in quello del 2012. Noi ci rifaremo alla definizione proposta nel primo studio, perché per quella del 2012 non vengono fornite tutte le indicazioni necessarie per effettuare il calcolo. La definizione è:

mes

dove 0,182 è il più basso valore che il prodotto a numeratore raggiunge nel controllo sano. Per il nostro paziente si ha:

MES = 0,0151/0,182 = 0,083

Gli autori associarono a ciascuno dei 71 pazienti il relativo indice MES e l’indice di Bell, riportando poi per ciascuno di essi un punto in un piano avente come ascissa l’indice di Bell e come ordinata il MES (vedi figura 3). Calcolarono poi la retta di regressione dei dati, la quale fornisce una funzione che permette di predire l’inidice di Bell, noto che sia il MES. Questa funzione si ricava facilmente dal grafico in figura 3 ed è data da:

Indice di Bell = 1 + 7,5MES

Per il nostro paziente restituisce un indice di Bell di 1.6, quindi diciamo 2. Questo corrisponde a 20 nella scala di Bell (che è dieci volte il valore di quello che abbiamo chiamato qui indice di Bell). Riporto la descrizione dei valori 20-30 della scala di Bell:

  • 20. Sintomi da severi a moderati a riposo. Incapace di svolgere attività impegnative. Incapace di lasciare casa, se non raramente. Confinato a letto per la maggior parte del tempo. Incapace di concentrarsi per più di un’ora al giorno. Funzionalità complessiva al 30-50% del normale.
  • 30. Sintomi da severi a moderati a riposo. Sintomi severi dopo qualunque tipo di esercizio. Generalmente confinato a casa. Incapace di svolgere qualunque attività impegnativa. Capace di svolgere lavoro al tavol per 2-3 ore al giorno, con bisogno di periodi di riposo. Funzionalità complessiva al 50%.

Il soggetto in effetti si colloca esattamente a questo livello di funzionamento, e questa è stata la qualità della sua vita per la maggior parte della sua annosa malattia, con brevi oscillazioni verso livelli maggiori di funzionamento. Si osservi che la funzionalità complessiva riportata nella scala di Bell è un indice che vuole tener conto anche delle funzioni organiche più semplici, come respirare e digerire; non è misura della produttività del soggetto.

mes-2
Per ciascun paziente si riporta un punto sul piano che ha in ascissa l’indice di Bell (che è dato dal valre sulla scala di Bell, diviso 10) e il MES in ordinate. E’ evidenziata in rosso la retta di regressione e i punto che individuano i tre pazienti portati come esempio (Myhill S et al, 2009). Sono evidenziati in rosso i punti relativi ai tre pazienti discussi in questo testo.

Le due ME/CFS

Booth e colleghi notarono che i pazienti della coorte 2 si distinguevano in due gruppo ben diversi fra loro. In un gruppo ricadevano pazienti con una attività glicolitica elevata (ATP_ini basso) e nell’altro coloro con una valore normale di questo parametro. Fu possibile inoltre notare che il primo gruppo presentava una ridotta funzione di trasporto dell’ATP fuori dai mitocondri (LT_in basso), mentre il secondo gruppo presentava un LT_in più alto del normale. Entrambi i gruppi presentano un basso trasporto di ADP dentro i mitocondri (vedi figura 4.A, 4.B, 4.C). In definitiva è possibile distinguere nella ME/CFS i seguenti due gruppi:

  • Gruppo HI Blk: individui con una respirazione particolarmente compromessa (ATP_oss basso), una compromisione del trasporto di ATP fuori dai mitocondri (TL_in basso) e di ADP dentro i mitocondri (TL_out basso);
  • Gruppo HI TL_in: individui con un normale equilibrio fra respirazione e glicolisi (ATP_oss normale), una iperattività del trasporto di ATP fuori dai mitocondri (TL_in alto) e una compromisione del trasporto di ADP dentro i mitocondri (TL_out basso).

Il paziente del nostro esempio appartiene al gruppo HI Blk, mentre gli altri due pazienti discussi nel seguito appartengono all’altro gruppo (vedi figura 4.A). Gli autori suggeriscono che la riduzione della respirazione nel gruppo HI Blk sia causata dal blocco di ANT nella funzione di trasporto di ATP fuori di mitocondri (Booth L et al. 2012). Nel gruppo HI Blk si potrebbe pensare che vi sia un blocco complessivo dell’enzima ANT, genetico o epigenetico. Nel gruppo HI TL_in invece abbiamo un’iperattività di questo enzima la quale potrebbe rappresentare un qualche meccanismo di compensazione. E’ bene ricordare che ANT si trova a cavallo della membrana interna del mitocondrio, e dunque attinge ADP dallo spazio fra membrana esterna e mebrana interna. Questo permette di formulare la seguente ipotesi:

  • Nel gruppo HI TL_in qualcosa nello spazio fra le due membrane del mitocondrio interferisce con l’interazione fra ADP e ANT. Questo porta a una sovra esepressione di questo enzima, come misura di compenso, che si manifesta come un aumento del trasporto di ATP fuori dalla matrice mitocondriale da parte di ANT stesso.
tl-in
Figura 4. Nella cohort 2 di distinguono due gruppi di pazienti ben differenziati. Uno, nominato Hi TL IN, presenta un valore più alto del normale di TL IN associato a un normale ATP_oss; l’altro, nominato Hi Blk, presenta un basso TL IN associato a un basso ATP_oss (Booth L et al. 2012). In figura sono riportate anche le coordinate dei tre pazienti esaminati. Il pz. 1 appartiene al gruppo Hi Blk, gli altri due al gruppo Hi TL IN.

L’origine del blocco

Gli Autori suggeriscono che l’umento di TL_in sia dovuto a una mancanza di substrato della catena respiratoria, ovvero ADP, fosfato inorganico, CoQ10, NADH, Mg. La mancanza di ADP potrebbe essere dovuta a sua volta al blocco di ANT nella sua funzione di trasporo di ADP dal citoplasma ai mitocondri, infatti l’89% del gruppo HI TL_in presenta un basso valore di TL_out (figura 4). Da notare che anche il gruppo HI Blk presenta in buona parte (78%) un basso LT_out (figura 4). Complessivamente tutti i pazienti della coorte 2 presentano almeno una delle due vie di trasporto bloccate. Questo induce gli autori a pensare che l’enzima ANT svolga un ruolo centrale nel determinare la disfunzione mitocondriale alla base della ME/CFS. Tra le possibili origine del blocco dell’enzima ANT gli Autori menzionano i seguenti fattori:

  • prodotti del metabolismo di virus o batteri;
  • sostanze di scarto prodotte da un danno ai tessuti;
  • sostanze chimiche di origine ambientale (Booth L et al. 2012).
mes-3
Figura 5. Sono riportati i dati del paziente usato come esempio (paziente 1), e di altri due pazienti (paziente 2 e paziente 3). In arancio sono riportati i valori sopra la norma, in azzurro quelli sotto la norma. Nella colonna a destra si riporta inoltre il significato di ciascuna misura. I parametri usati per il calcolo del MES (secondo lo studio del 2009) sono 1, 3, 8, 12, 13. Nello studio del 2012 il parametro 13 fu sostituito dal 6.

Tre pazienti

Riporto sinteticamente i dati del paziente che abbiamo discusso sopra (paziente uno) e di altri due pazienti (vedi figura 5). Discuto ora brevemente i tre casi.

Paziente 1. Si possono fare le seguenti osservazioni.

  • Complessivamente la sintesi di ATP è poco efficiente, come suggeriscono i valori ATP^Mg_1 e ATPmito_1, entrambi bassi.
  • Il rapporto tra ATP senza aggiunta di magnesio e ATP con aggiunta di Mg (valore 3 in figura 4) è basso, e questo suggerisce probabilmente una insufficienza di Mg intracellulare  (Booth, N et al 2012).
  • Esiste uno sbilancio fra la glicolisi e la respirazione (ATP_in alto) che probabilmente riflette un blocco della respirazione. Questo sembra giustificare il valore complessivamente basso dell’ATP intracellulare.
  • La catena respiratoria ha uno scarso recupero dallo stress chimico costituito dall’azoturo di sodio (OxPhos basso).
  • Si nota la capacità estremamente ridotta di ANT di traslocare ATP fuori dai mitocondri. Infatti si ha una riduzione relativa del 13,8% tra ATPmito_3 e ATPmito_1, dove normalmente si registra una riduzione fra 55 e 75%. Questo probabilemnte giustifica il fatto che la misura ATPmito_3 sia nella norma. Infatti dopo la rimozione del bagno di ADP, l’ATP fatica a uscire dal mitocondrio e rimane all’interno.
  • Anche il trasporto di ADP dentro i mitocondri è inibito (LT_out basso) e quindi si può dire che complessivamente l’enziam ANT è poco funzionale.
  • Carenza di magnesio intracellulare, bassa attività di respirazione, elevata sensibilità della catena respiratoria a stress chimici, e blocco dell’enzima ANT sono in accordo con un MES di solo 0.083, che si traduce in un 20 della scala di Bell, ovvero una condizione di ME/CFS severa.
  • Scala di Bell: 20. Sintomi da severi a moderati a riposo. Incapace di svolgere attività impegnative. Incapace di lasciare casa, se non raramente. Confinato a letto per la maggior parte del tempo. Incapace di concentrarsi per più di un’ora al giorno. Funzionalità complessiva al 30-50% del normale.

Paziente 2.  Si possono fare le seguenti osservazioni.

  • Complessivamente la sintesi di ATP è poco efficiente, come suggeriscono i valori ATP^Mg_1 e ATPmito_1, entrambi bassi.
  • Il rapporto tra ATP senza aggiunta di magnesio e ATP con aggiunta di Mg (valore 3 in figura 4) è basso, e questo suggerisce probabilmente una insufficienza di Mg intracellulare  (Booth, N et al 2012).
  • I valori ATP_ini e ATP_oss sono normali, a indicare un buon equilibrio tra glicolisi e respirazione.
  • La catena respiratoria ha uno scarso recupero dallo stress chimico costituito dall’azoturo di sodio (OxPhos basso).
  • Spiccata la capacità di ANT di traslocare ATP fuori dai mitocondri. Infatti si ha una riduzione relativa del 77,5% tra ATPmito_3 e ATPmito_1, dove normalmente si registra una riduzione fra 55 e 75%. Questo alto valore di TL_in contribuisce a migliorare il MES del paziente. E’ plausibile pensare che questa sovra attivazione dell’enzima ANT sia una forma di compensazione per la inadeguata capacità del soggetto di sintetizzare ATP (ATP^Mg_1 e ATPmito_1 bassi).
  • Il trasporto di ADP dentro i mitocondri è inibito (LT_out basso) e forse contribuisce al difetto di ATP intracellulare del soggetto.
  • Carenza di magnesio intracellulare, elevata sensibilità della catena respiratoria a stress chimici, e blocco dell’enzima ANT nel trasporto di ADP dentro i mitocondri, contribuiscono a determinare un MES di 0.57, che si traduce in un 50 della scala di Bell, ovvero una condizione di ME/CFS moderata.
  • Scala di Bell: 50. Sintomi moderati a riposo. Sintomi da severi a moderati dopo esercizio o attività. Incapace di svolgere mansioni impegnative, ma può svolgere lavori leggeri o lavoro al tavolo per 4-5 ore al giorno, avendo però bisogno di periodi di riposo. Funzionalità complessiva al 70% del normale.

Paziente 3.  Non ci sono sostanziali differenze con il profilo del paziente 2.

Confronto con altri studi

In una recente pubblicazione italo-tedesca su due gemelli omozigoti, uno dei quali con ME/CFS (l’atro sano), l’enzima ADP/ATP translocasi risulta sotto espresso nel fratello malato, rispetto al fratello sano (Ciregia F et al 2016). Questa ridotta espressione potrebbe essere la causa del complessivo scarso funzionamento dell’enzima nel gruppo HI Blk, oppure potrebbe essere una misura di compenso per il funzionamento eccessivo della traslocazione di ATP fuori dai mitocondri rilevata nel gruppo HI TL_in. Difficile fare ipotesi, ma questa coincidenza è interessante.

Due recenti studi metabolomici hanno apparentemente individuato quelli che sembrano essere due diversi tipi di ME/CFS. In uno è stata descritta una anomalia metabolica caratterizzata da lattato elevato e da un difetto nel ciclo di Krebs (Yamano E, et al. 2016); in un altro invece si è riportato un difetto della glicolisi, con ridotto piruvato e lattato (Armstrong CW et al. 2015). Si potrebbe speculare che i pazienti descritti da Yamano appartengano al gruppo HI Blk, mentre quelli descritti da Armstrong siano del tipo HI LT_in.

Test ergospirometrici eseguiti due giorni di seguito sui pazienti ME/CFS, hanno dimostrato nella prova del secondo giorno che la soglia anaerobica entra precocemente e in definitiva i pazienti consumano meno ossigeno per erogare un watt, rispetto a un soggetto normale (anche sedentario) (Vanness, 2007), (Snell, 2013). Quindi i pazienti farebbero maggiore affidamento sul sistema anaerobico per produrre energia, esattamente come il gruppo HI Blk.

Approfondimenti

Mitocondri giapponesi e le due ME/CFS

Mitocondri giapponesi e le due ME/CFS

Pazienti, campioni e strumentazione

In un recentissimo studio giapponese (Yamano E, et al. 2016) 67 adulti con diagnosi di ME/CFS (criteri Fukuda) e 66 controlli sani sono stati sottoposti a un dettagliato esame metabolico. Il loro sangue periferico è stato analizzato attraverso un particolare tipo di spettroscopia di massa (capillar electrophoresis timo-of-flight mass spectrometry, CE-TOFMS) in grado di individuare 144 metaboliti distinti nel medesimo campione. Tra queste molecole ne sono state individuate in particolare 31, relative alla glicolisi, al ciclo di Krebs (o ciclo dell’acido tricarbossilico, TCA), e al ciclo dell’urea (vedi figura 1).

mitocondri giapponesi.png
Figura 1. Livelli di alcuni metaboliti della glicolisi, del ciclo di Krebs e del ciclo dell’urea nei pazienti ME/CFS e nel controllo sano (Yamano E. et al. 2016).

Glicolisi

Ricordo che la glicolisi avviene nel citoplasma (fuori dai mitocondri) e permette di ricavare due molecole di ATP da ogni molecola di glucosio. Lo scarto della glicolisi consiste in due molecole di piruvato, per ciascuna molecola di glucosio processata. I ricercatori giapponesi hanno rilevato come unica anomalia di questa parte iniziale del metabolismo energetico, un aumento del suo prodotto finale, ovvero del piruvato (vedi figura 1). Ciò nonostante, il glucosio e il lattato vengono mantenuti in parametri normali, probabilmente grazie a una serie di sistemi di compensansione.

Ciclo di Krebs

Ricordo che il piruvato è il carburante che alimenta la seconda fase del metabolismo energetico, che si verifica all’interno dei mitocondri. In questa seconda fase, il piruvato è convertito in Acetil-CoA (con la sintesi di 3 molecole di ATP per ciascun piruvato), e l’Acetil-CoA è poi inviato al ciclo di Krebs (o ciclo dell’acido citrico), dove sono prodotte altre 12 molecole di ATP per ogni molecola di Acetil-CoA. Più precisamente, il ciclo di Krebs produce una molecola di ATP, tre di NADH e una di FADH2; queste due ultime molecole vengono inviate alla fosforilazione ossidativa (membrana dei mitocondri) dove sono utilizzate per sintetizzare complessivamente 11 molecole di ATP. I ricercatori giapponesi hanno rilevato una complessiva riduzione dei metaboliti del ciclo di Krebs, ma in particolare la depressione riguarda la parte iniziale, ovvero il citrato e l’isocitrato.

Il ciclo dell’urea

Ricordo che il ciclo dell’urea si occupa di smaltire i rifiuti del metabolismo degli amminoacidi, producendo urea a partire da ammoniaca (NH3). Nello studio giapponese è stato riscontrato un aumento di ornitina, e una sensibile riduzione di citrullina.

Un test metabolico per la CFS

In base a quanto sopra, gli Autori dello studio hanno concluso che i cinque metaboliti ornitina, citrullina, piruvato, lattato, e isocitrato sono quelli che con maggiore evidenza possono rappresentare il difetto metabolico dei pazienti ME/CFS. In particolare i ricercatori hanno riscontrato come la combinazione di valori alti per i due rapporti ornitina/citrullina e piruvato/isocitrato  fornisca un test per discriminare i pazienti ME/CFS dal controlo sano (vedi figura 2).

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Figura 2. Il rapporto piruvato/isocitrato (glicolisi e ciclo di Krebs) e il rapporto ornitina/citrullina (ciclo dell’urea) discriminano tra ME/CFS e controllo sano (Yamano E. et al 2016).

Dove sta il problema?

Secondo Yamano e colleghi, l’analisi di questi dati suggerisce un qualche difetto nei passaggi che vanno dal piruvato all’isocitrato. Ovvero il blocco metabolico si estende tra l’ingresso del piruvato nei mitocondri e la parte iniziale del ciclo di Krebs. I ricercatori affermano espressamente che:

la ridotta concentrazione dei metaboliti della fase iniziale del ciclo di Krebs verosimilmente rappresenta il processo patologico alla base della fatica.

Giappone vs Italia

Uno studio europeo che ha indagato l’espressione di due enzimi mitocondriali nella saliva di pazienti ME/CFS reclutati dall’Ospedale santa Chiara di Pisa, ha riportato recentemente una alta espressione di due enzimi chiave del metabolismo mitocondriale, ovvero la subunità beta della ATP sintetasi (ATPB, complesso V in figura 3) e l’aconitasi mitocondriale (ACON) (Ciregia F et al 2016). Una mia sintesi di questo studio è disponibile qui. Quello che ci interessa in questa sede è rilevare una certa coerenza fra lo studio europeo e quello giapponese, infatti se ammettiamo che il ciclo di Krebs è bloccato nella sua fase iniziale, possiamo immaginare che il sistema cercherà di compensare aumentando l’espressione di alcuni o tutti gli enzimi a valle del blocco, al fine di estrarre ogni possibile risorsa dal substrato disponibile. Ora si dà il caso che ACON è proprio l’enzima che catalizza la reazione da citrato a isocitrato. Mentre ATPB fa parte del complesso enzimatico con cui culmina la catena respiratoria, con sintesi di ATP da ADP. Si ravvisa dunque un possibile accordo fra i due studi, e questo è un ottimo segno.

Giappone vs Australia

Nel 2015 uno studio australiano sul metabolismo della ME/CFS (Armstrong CW et al. 2015) ha rilevato dati per molti aspetti opposti rispetto a quelli riportati da Yamano e colleghi. Infatti gli australiani hanno dedotto l’esistenza di un blocco della glicolisi (a monte del piruvato) dalla ridotta abbondanza di piruvato e lattato (esattamente il contrario di quanto riportato dai giapponesi) e hanno riscontrato l’uso di amminoacidi come fonte alternativa di carburante nel ciclo di Krebs. Da notare anche che per gli australiani il rapporto ornitina/citrullina è ridotto nella ME/CFS rispetto ai controlli sani, non aumentato! Tuttavia è interessante rilevare che un blocco della glicolisi produrrebbe comunque un blocco del ciclo di Krebs, quindi in entrambe le condizioni descritte il quandro clinico sarebbe probabilmente lo stesso. E sia lo studio australiano che quello giapponese sono coerenti con quello sui pazienti toscani.

Giappone vs Inghilterra

Tra il 2009 e il 2013 un gruppo inglese costituito dal fisico Norman Booth, dal medico Sarah Myhill, e da McLaren-Howard ha prodotto una serie di studi sui mitocondri dei neutrofili estratti dal sangue periferico di pazienti ME/CFS (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012), (Myhill S et al. 2013) in cui dimostrarono una complessiva perdita di efficienza di questi organelli, in parte riconducibile a un difetto dell’enzima ADP/ATP translocator (ANT in figura 3), specialmente nella sua funzione di esportazione di ATP da dentro i mitocondri al citoplasma. Sorprendentemente questo enzima è sottoespresso, secondo lo studio sui pazienti italiani. Tuttavia questo dato non permette di dedurre nulla di particolare sul ciclo di Krebs, e quindi non è possibile fare un confronto fra gli studi inglesi e quello giapponese e australiano.

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Figura 3. La catena respiratoria (Cohen BH, Gold, DR, 2001).

Giappone vs California

In un precedente post ho provato a discutere i dati metabolici di Whitney Dafoe, il figlio del celebre genetista Ronald Davis (Stanford University), il quale è stato sottoposto per primo a un nuovo test metabolmico, uno dei più completi esistenti (circa 400 metaboliti). Quello che risulta dal suo test è una complessiva inibizione sia della glicolisi che del ciclo di Krebs. In questo caso dunque si ha un paziente che rientrerebbe nel profilo descritto dagli australiani, e non in quello descritto dai giapponesi, anche se non è possibile fare un confronto diretto con lo studio australiano, che non prevede l’analisi diretta dei metaboliti del TCA.

Tutte le strade portano alla ME/CFS

Si deve ammettere che lo studio giapponese non è coerente con quello australiano, tuttavia emerge una possibilità: che i due studi abbiano descritto due diversi difetti metabolici (blocco della parte iniziale del TCA nel primo, e della glicolisi nel secondo) che portano entrambi allo stesso quadro clinico, ovvero alla ME/CFS. Infatti tanto in un caso, che nell’altro, si avrebbe una depressione dl ciclo di Krebs. In entrambi i casi si avrebbe poi un quadro compatibile con la sovra espressione degli enzimi ATPB e ACON (studio europeo). Quest’ultimo studio riporta poi una sotto espressione dell’enzima ANT, che sembra disfunzionale negli studi inglesi. Il caso di Whitney è in fine compatibile con lo studio australiano. L’esito finale è in ogni caso una deplezione di ATP che può ben essere la causa di deficit cognitivi, della post-exertional malaise, della fatica a riposo, e della POTS. Ovvero di ciò che chiamiamo comunemente ME/CFS.

Conclusione e prospettive

In conclusione, sembrano essere almeno due le strade metaboliche che portano alla ME/CFS. Una mia ricerca, attualemnte in corso e basata per il momento sui dati di soli due pazienti, potrebbe spiegare entrambe questi difetti metabolici, attraverso un fenomeno autoimmune. Basta infatti considerare che…