Introduzione

Il lavoro di Naviaux e colleghi della University of San Diego sull’ipometabolismo nella ME/CFS, ha fornito dati convincenti a favore di una riduzione del metabolismo energetico in questa patologia (Naviaux R et al. 2016). Una interpretazione analoga è stata suggerita sulla base di un diverso set di dati da uno studio precedente (Armstrong CW et al. 2015) e da uno successivo (Yamano E, et al. 2016), mentre arrivano conferme ufficiose di questa ipotesi da Olav Mella (Universitetet i Bergen, Norvegia) e da Maureen Hanson (Cornell University, USA). Infatti sia i norvegesi che la Cornell University hanno riferito di studi (non ancora pubblicati) che confermano l’ipometabolismo.

A volte ritornano, l’epopea dei neutrofili

In questo contesto mi sembra allora utile riesumare una serie di tre studi pubblicati tra il 2009 e il 2013 da un gruppo inglese costituito dal fisico Norman Booth, dal medico Sarah Myhill, e da McLaren-Howard (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012), (Myhill S et al. 2013). In questi lavori gli autori dimostrarono una complessiva depressione del metabolismo energetico dei neutrofili estratti dal sangue periferico di 71 pazienti con diagnosi di ME/CFS (criteri Fukuda) e presentarono un test, denominato ‘ATP profile’, in grado non solo di separare completamente i soggetti malati dai 53 controlli sani, ma anche di predire il livello di disabilità dei pazienti, espresso in termini di scala di Bell, un indice numerico sviluppato dal dr. David Bell. Gli esperimenti di Myhill e colleghi non sono stati mai replicati da un altro gruppo, e inoltre riguardano solo i neutrofili. Tuttavia oggi sappiamo, come detto, che tutte le cellule del corpo presentano un difetto energetico nella ME/CFS. Quindi sembra possibile che ciò che trovarono nei neutrofili sia un dato reale ed estendibile a tutte le cellule del corpo. Pertanto descrivo in quanto segue il test ‘ATP profile’ (che consta della misura di diversi parametri) e i risultati degli studi di Myhill e colleghi, alla luce delle nuove scoperte.

Il test ‘ATP profile’

Il test si basa sulla misura dell’ATP sia all’interno dei neutrofili che all’interno dei mitocondri dei neutrofili, in diverse condizioni sperimentali. I neutrofili furono estratti dal sangue periferico di 71 pazienti e 53 controlli sani nel primo esperimento (Myhill S et al. 2009). In un secondo lavoro, la misurazione fu effettuata su un secondo gruppo di 138 pazienti (cohort 2) mentre i dati del primo esperimento furono riesaminati, dopo aver escluso 10 pazienti con età non compresa tra i 18 e i 65 anni, ottenendo così un campione di 61 persone (cohort 1) (Booth, N et al 2012). La misura del contenuto di ATP si basa su una metodica sviluppata nell’immediato dopoguerra (McElroy WD, 1947). In quello che segue descrivo il test, così come è presentato nello studio del 2009, e discuto i risultati di un soggetto che si è sottoposto all’esame.

ant
Figura 1. La catena respiratoria (Cohen BH, Gold DR. 2001).

Contenuto di ATP nei neutrofili. Viene misurata la concentrazione di ATP in presenza di eccesso di magnesio (ATP^Mg_1) e viene espressa in nano moli per milione di neutrofili (Myhill S et al. 2009). Nel caso che portiamo come esempio si ha:

ATP^Mg_1 = 1.38 nmol/(10^6 cell.)          [1.6-2.9]

Oltre a questa misura di ATP, se ne effettua una seconda, senza aggiunta di magnesio. La indichiamo ATP e nel nostro esempio vale:

ATP = 0.84 nmol/(10^6 cell.)              [0.9-2.7]

Gli autori calcolano poi il rapporto tra la seconda e la prima misura (Myhill S et al. 2009). Nel nostro paziente abbiamo:

ATP/ATP^Mg_1 = 0.53              [>0.65]

Gli Autori rilevano che il controllo sano presenta un valore medio di questo rapporto di 0.686 con una deviazione standardi di 0.032, e suggeriscono che il basso valore di questo rapporto nei pazienti sia indice di una carenza di Mg intracellulare. Questa carenza ha conseguenze fisiologiche importanti poiché il Mg è un elemento essenziale affinché l’enzima ATPase svolga la sua funzione, che è quella di ricavare energia dalla degradazione di ATP in ADP  (Booth, N et al 2012).

Glicolisi. Si inibisce la catena respiratoria utilizzando azoturo di sodio, il quale blocca sia l’enzima ATP sintetasi (complesso V in figura 1) che il citocromo a3 (complesso IV in figura 1). A questo punto viene meno la respirazione e i neutrofili consumano rapidamente lle riserve di ATP. Dopo alcuni minuti viene misurato il contenuto di ATP dei neutrofili (Myhill S et al. 2009). Detto ATP^Mg_2 questo valore, nel nostro esempio si ha:

ATP^Mg_2 = 0.32 nmol/(10^6 cell.)          [<o.3]

Gli Autori osservano che nei neutrofili dei soggetti sani l’inibizione dlla catena respiratoria porta a un rapido crollo dell’ATP a un valore pari al 7.5% del valore iniziale, con una deviazione standard di 3.4%. Questo sembra coerente con la possibilità che il metabolismo dei neutrofili sotto l’effetto dell’azoturo di sodio sia sostenuto solo dalla glicolisi (Booth, N et al 2012). In effetti la glicolisi produce due molecole di ATP per molecola di glucosio, mentre il ciclo di Krebs accoppiato alla respirazione ne produce 36, di cui 2 in condizioni anaerobiche. Dunque con inibzione della respirazione si avrebbe una riduzione teorica della sintesi di ATP a 4/34, ovvero 12% circa di quanto prodotto in condizioni aerobiche. Quindi il parametro:

ATP_ini = (ATP^Mg_2/ATP^Mg_1)

si può considerare una misura del contributo della sintesi anaerobica di energia. Nel caso del nostro paziente si ha:

ATP_ini = 0.232            [0.04-0.11]

Come riferimento, in questo caso, ho usato la media più o meno una deviazione standard, piuttosto che i valori forniti nel referto.

Respirazione. L’azoturo di sodio viene rimosso e si misura nuovamente il contenuto di ATP nei neutrofili, dopo un intervallo di tempo assegnato (3 minuti). Questa misura fornisce il valore ATP^Mg_3 e gli Autori riportano che a inibizione rimossa, il livello di ATP nei neutrofili del controllo sano aumenta a un 60-90% del valore iniziale ATP^Mg_1. A questo punto introducono il rapporto:

OxPhos = (ATP^Mg_3-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1-ATP^Mg_2)

che propongono come una misura della efficienza della respirazione (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012). Nel nostro esempio si ha:

ATP^Mg_2 = 0.32 nmol/(10^6 cell.)          [<o.3]

ATP^Mg_3 = 0.87 nmol/(10^6 cell.)          [>1.4]

Si ottiene allora:

    OxPhos = (ATP^Mg_3-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1-ATP^Mg_2) = 0.519        [>60]

Purtroppo, a mio parere, OxPhos è piuttosto una misura della capacità della catena di trasporto degli elettroni di riprendersi dalla inibizione con azoturo di sodio, quindi una generica misura della salute della catena di trasporto. Come misura del contributo della ossidazione alla produzione di energia propongo invece il parametro:

ATP_oss = ( ATP^Mg_1-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1) = 1 – ATP_ini

Nel nostro caso si ha

ATP_oss = 0.768            [0.89-0.96]

Come riferimento, in questo caso, ho usato la media più o meno una deviazione standard, piuttosto che i valori forniti nel referto.

translocase.png
Figura 2. ADP/ATP translocasi (Bos taurus), da Protein Dat Bank, ID 10KC, con modifiche. In blu la superficie dlla membrana interna del mitocondrio (che si affaccia sulla matrice), in rosso la superficie che si affaccia sullo spazio compreso tra membrana mitocondriale interna e membrana mitocondriale esterna.

ADP/ATP translocasi. Questo enzima (riportato come ANT in figura 1) permette l’ingresso dell’ADP all’interno della matrice mitocondriale, dove viene convertito in ATP dall’enzima ATP sintetasi (complesso V in figura 1). ANT si estende tra la superficie esterna e la superficie interna della membrana interna dei mitocondri (figura 2). Presenta quattro isoforme negli esseri umani (ADT1, ADT2, ADT3, ADT4) probabilmente tessuto-specifiche. Il trasferimento di ADP e ATP è molto dispendioso e richiede il 25% della energia prodotta dalla respirazione (Kilngerberg M, 2008). Se l’enzima ANT non funziona correttamente, ne risulta una inibizione della catena di trasporto degli elettroni, del piruvato deifrogenasi (che converte il piruvato in Acetil-CoA), e di tutto il ciclo di Krebs (Pieczenik SR, Neustadt J, 2006).

Misura della efficienza di ADP/ATP translocasi. Durante l’esecuzione dell’ATP profile alcuni mitocondri vengono estratti dai neutrofili e il loro contenuto di ATP viene misurato. Detto ATPmito_1 questo valore, nel caso del nostro soggetto si ha:

ATPmito_1 = 225 pmol/(10^6 cell.)          [290-700]

dove ‘cell’ non si riferisce più ai neutrofili, ma ai mitocondri. Inoltre in questo caso la misura è in pico moli, cioè 10^(-12) moli. A questo punto un secondo campione di mitocondri è immerso in un bagno di ADP in modo da indurre l’enzima ANT a far entrare ADP nei mitocondri. Segue una nuova misura dell’ATP mitocondriale, che indichiamo ATPmito_2. Nel nostro esempio si è misurato il seguente valore:

ATPmito_2 = 290 pmol/(10^6 cell.)          [410-950]

Ci si aspetta un aumento di ATP perché l’ADP è uno degli ingredienti fondamentali per la sua sintesi. Nel nostro soggetto l’aumento è minimo, e questo viene interpretato dagli Autori come una scarsa capacità dell’enzima ANT di far entrare ADP nel mitocondrio. A questo punto il pH di una terza coltura di mtocondri è modificato (portato a 8.9 ± 0.2) in maniera da favorire la fuoriuscita di ATP dai mitocondri, sempre attraverso l’enzima ANT. Il contenuto di ATP dei mitocondri è quindi nuovamente misurato, fornendo il parametro ATPmito_3, che nel nostro soggetto è:

ATPmito_3 = 194 pmol/(10^6 cell.)          [140-330]

Da queste misure gli autori ricavano i seguenti due quozienti:

TL_out = (ATPmito_2-ATPmito_1)/ATPmito_1

TL_in = (ATPmito_3-ATPmito_1)/ATPmito_1

Il primo valore è proposto come una misura della efficienza di ANT nel traslocare ADP dal citoplasma a dentro i mitocondri; il secondo rapporto fornirebbe invece una misura della efficienza dello stesso enzima nel traslocare ATP dai mitocondri, dove è prodotto, al citoplasma (Myhill S et al. 2009).  Nel caso portato come esempio si ha

TL_out = 0.289        [>0.35]

TL_in = 0.138        [55-75]

Mitochondrial energy score. Gli autori hanno proposto un indice che riassume l’efficienza del sistema energetico dei mitocondri, chiamato Mitochondrial Energy Score (MES). Questo indice è stato definito in modo diverso nello studio del 2009 e in quello del 2012. Noi ci rifaremo alla definizione proposta nel primo studio, perché per quella del 2012 non vengono fornite tutte le indicazioni necessarie per effettuare il calcolo. La definizione è:

mes

dove 0,182 è il più basso valore che il prodotto a numeratore raggiunge nel controllo sano. Per il nostro paziente si ha:

MES = 0,0151/0,182 = 0,083

Gli autori associarono a ciascuno dei 71 pazienti il relativo indice MES e l’indice di Bell, riportando poi per ciascuno di essi un punto in un piano avente come ascissa l’indice di Bell e come ordinata il MES (vedi figura 3). Calcolarono poi la retta di regressione dei dati, la quale fornisce una funzione che permette di predire l’inidice di Bell, noto che sia il MES. Questa funzione si ricava facilmente dal grafico in figura 3 ed è data da:

Indice di Bell = 1 + 7,5MES

Per il nostro paziente restituisce un indice di Bell di 1.6, quindi diciamo 2. Questo corrisponde a 20 nella scala di Bell (che è dieci volte il valore di quello che abbiamo chiamato qui indice di Bell). Riporto la descrizione dei valori 20-30 della scala di Bell:

  • 20. Sintomi da severi a moderati a riposo. Incapace di svolgere attività impegnative. Incapace di lasciare casa, se non raramente. Confinato a letto per la maggior parte del tempo. Incapace di concentrarsi per più di un’ora al giorno. Funzionalità complessiva al 30-50% del normale.
  • 30. Sintomi da severi a moderati a riposo. Sintomi severi dopo qualunque tipo di esercizio. Generalmente confinato a casa. Incapace di svolgere qualunque attività impegnativa. Capace di svolgere lavoro al tavol per 2-3 ore al giorno, con bisogno di periodi di riposo. Funzionalità complessiva al 50%.

Il soggetto in effetti si colloca esattamente a questo livello di funzionamento, e questa è stata la qualità della sua vita per la maggior parte della sua annosa malattia, con brevi oscillazioni verso livelli maggiori di funzionamento. Si osservi che la funzionalità complessiva riportata nella scala di Bell è un indice che vuole tener conto anche delle funzioni organiche più semplici, come respirare e digerire; non è misura della produttività del soggetto.

mes-2
Per ciascun paziente si riporta un punto sul piano che ha in ascissa l’indice di Bell (che è dato dal valre sulla scala di Bell, diviso 10) e il MES in ordinate. E’ evidenziata in rosso la retta di regressione e i punto che individuano i tre pazienti portati come esempio (Myhill S et al, 2009). Sono evidenziati in rosso i punti relativi ai tre pazienti discussi in questo testo.

Le due ME/CFS

Booth e colleghi notarono che i pazienti della coorte 2 si distinguevano in due gruppo ben diversi fra loro. In un gruppo ricadevano pazienti con una attività glicolitica elevata (ATP_ini basso) e nell’altro coloro con una valore normale di questo parametro. Fu possibile inoltre notare che il primo gruppo presentava una ridotta funzione di trasporto dell’ATP fuori dai mitocondri (LT_in basso), mentre il secondo gruppo presentava un LT_in più alto del normale. Entrambi i gruppi presentano un basso trasporto di ADP dentro i mitocondri (vedi figura 4.A, 4.B, 4.C). In definitiva è possibile distinguere nella ME/CFS i seguenti due gruppi:

  • Gruppo HI Blk: individui con una respirazione particolarmente compromessa (ATP_oss basso), una compromisione del trasporto di ATP fuori dai mitocondri (TL_in basso) e di ADP dentro i mitocondri (TL_out basso);
  • Gruppo HI TL_in: individui con un normale equilibrio fra respirazione e glicolisi (ATP_oss normale), una iperattività del trasporto di ATP fuori dai mitocondri (TL_in alto) e una compromisione del trasporto di ADP dentro i mitocondri (TL_out basso).

Il paziente del nostro esempio appartiene al gruppo HI Blk, mentre gli altri due pazienti discussi nel seguito appartengono all’altro gruppo (vedi figura 4.A). Gli autori suggeriscono che la riduzione della respirazione nel gruppo HI Blk sia causata dal blocco di ANT nella funzione di trasporto di ATP fuori di mitocondri (Booth L et al. 2012). Nel gruppo HI Blk si potrebbe pensare che vi sia un blocco complessivo dell’enzima ANT, genetico o epigenetico. Nel gruppo HI TL_in invece abbiamo un’iperattività di questo enzima la quale potrebbe rappresentare un qualche meccanismo di compensazione. E’ bene ricordare che ANT si trova a cavallo della membrana interna del mitocondrio, e dunque attinge ADP dallo spazio fra membrana esterna e mebrana interna. Questo permette di formulare la seguente ipotesi:

  • Nel gruppo HI TL_in qualcosa nello spazio fra le due membrane del mitocondrio interferisce con l’interazione fra ADP e ANT. Questo porta a una sovra esepressione di questo enzima, come misura di compenso, che si manifesta come un aumento del trasporto di ATP fuori dalla matrice mitocondriale da parte di ANT stesso.
tl-in
Figura 4. Nella cohort 2 di distinguono due gruppi di pazienti ben differenziati. Uno, nominato Hi TL IN, presenta un valore più alto del normale di TL IN associato a un normale ATP_oss; l’altro, nominato Hi Blk, presenta un basso TL IN associato a un basso ATP_oss (Booth L et al. 2012). In figura sono riportate anche le coordinate dei tre pazienti esaminati. Il pz. 1 appartiene al gruppo Hi Blk, gli altri due al gruppo Hi TL IN.

L’origine del blocco

Gli Autori suggeriscono che l’umento di TL_in sia dovuto a una mancanza di substrato della catena respiratoria, ovvero ADP, fosfato inorganico, CoQ10, NADH, Mg. La mancanza di ADP potrebbe essere dovuta a sua volta al blocco di ANT nella sua funzione di trasporo di ADP dal citoplasma ai mitocondri, infatti l’89% del gruppo HI TL_in presenta un basso valore di TL_out (figura 4). Da notare che anche il gruppo HI Blk presenta in buona parte (78%) un basso LT_out (figura 4). Complessivamente tutti i pazienti della coorte 2 presentano almeno una delle due vie di trasporto bloccate. Questo induce gli autori a pensare che l’enzima ANT svolga un ruolo centrale nel determinare la disfunzione mitocondriale alla base della ME/CFS. Tra le possibili origine del blocco dell’enzima ANT gli Autori menzionano i seguenti fattori:

  • prodotti del metabolismo di virus o batteri;
  • sostanze di scarto prodotte da un danno ai tessuti;
  • sostanze chimiche di origine ambientale (Booth L et al. 2012).
mes-3
Figura 5. Sono riportati i dati del paziente usato come esempio (paziente 1), e di altri due pazienti (paziente 2 e paziente 3). In arancio sono riportati i valori sopra la norma, in azzurro quelli sotto la norma. Nella colonna a destra si riporta inoltre il significato di ciascuna misura. I parametri usati per il calcolo del MES (secondo lo studio del 2009) sono 1, 3, 8, 12, 13. Nello studio del 2012 il parametro 13 fu sostituito dal 6.

Tre pazienti

Riporto sinteticamente i dati del paziente che abbiamo discusso sopra (paziente uno) e di altri due pazienti (vedi figura 5). Discuto ora brevemente i tre casi.

Paziente 1. Si possono fare le seguenti osservazioni.

  • Complessivamente la sintesi di ATP è poco efficiente, come suggeriscono i valori ATP^Mg_1 e ATPmito_1, entrambi bassi.
  • Il rapporto tra ATP senza aggiunta di magnesio e ATP con aggiunta di Mg (valore 3 in figura 4) è basso, e questo suggerisce probabilmente una insufficienza di Mg intracellulare  (Booth, N et al 2012).
  • Esiste uno sbilancio fra la glicolisi e la respirazione (ATP_in alto) che probabilmente riflette un blocco della respirazione. Questo sembra giustificare il valore complessivamente basso dell’ATP intracellulare.
  • La catena respiratoria ha uno scarso recupero dallo stress chimico costituito dall’azoturo di sodio (OxPhos basso).
  • Si nota la capacità estremamente ridotta di ANT di traslocare ATP fuori dai mitocondri. Infatti si ha una riduzione relativa del 13,8% tra ATPmito_3 e ATPmito_1, dove normalmente si registra una riduzione fra 55 e 75%. Questo probabilemnte giustifica il fatto che la misura ATPmito_3 sia nella norma. Infatti dopo la rimozione del bagno di ADP, l’ATP fatica a uscire dal mitocondrio e rimane all’interno.
  • Anche il trasporto di ADP dentro i mitocondri è inibito (LT_out basso) e quindi si può dire che complessivamente l’enziam ANT è poco funzionale.
  • Carenza di magnesio intracellulare, bassa attività di respirazione, elevata sensibilità della catena respiratoria a stress chimici, e blocco dell’enzima ANT sono in accordo con un MES di solo 0.083, che si traduce in un 20 della scala di Bell, ovvero una condizione di ME/CFS severa.
  • Scala di Bell: 20. Sintomi da severi a moderati a riposo. Incapace di svolgere attività impegnative. Incapace di lasciare casa, se non raramente. Confinato a letto per la maggior parte del tempo. Incapace di concentrarsi per più di un’ora al giorno. Funzionalità complessiva al 30-50% del normale.

Paziente 2.  Si possono fare le seguenti osservazioni.

  • Complessivamente la sintesi di ATP è poco efficiente, come suggeriscono i valori ATP^Mg_1 e ATPmito_1, entrambi bassi.
  • Il rapporto tra ATP senza aggiunta di magnesio e ATP con aggiunta di Mg (valore 3 in figura 4) è basso, e questo suggerisce probabilmente una insufficienza di Mg intracellulare  (Booth, N et al 2012).
  • I valori ATP_ini e ATP_oss sono normali, a indicare un buon equilibrio tra glicolisi e respirazione.
  • La catena respiratoria ha uno scarso recupero dallo stress chimico costituito dall’azoturo di sodio (OxPhos basso).
  • Spiccata la capacità di ANT di traslocare ATP fuori dai mitocondri. Infatti si ha una riduzione relativa del 77,5% tra ATPmito_3 e ATPmito_1, dove normalmente si registra una riduzione fra 55 e 75%. Questo alto valore di TL_in contribuisce a migliorare il MES del paziente. E’ plausibile pensare che questa sovra attivazione dell’enzima ANT sia una forma di compensazione per la inadeguata capacità del soggetto di sintetizzare ATP (ATP^Mg_1 e ATPmito_1 bassi).
  • Il trasporto di ADP dentro i mitocondri è inibito (LT_out basso) e forse contribuisce al difetto di ATP intracellulare del soggetto.
  • Carenza di magnesio intracellulare, elevata sensibilità della catena respiratoria a stress chimici, e blocco dell’enzima ANT nel trasporto di ADP dentro i mitocondri, contribuiscono a determinare un MES di 0.57, che si traduce in un 50 della scala di Bell, ovvero una condizione di ME/CFS moderata.
  • Scala di Bell: 50. Sintomi moderati a riposo. Sintomi da severi a moderati dopo esercizio o attività. Incapace di svolgere mansioni impegnative, ma può svolgere lavori leggeri o lavoro al tavolo per 4-5 ore al giorno, avendo però bisogno di periodi di riposo. Funzionalità complessiva al 70% del normale.

Paziente 3.  Non ci sono sostanziali differenze con il profilo del paziente 2.

Confronto con altri studi

In una recente pubblicazione italo-tedesca su due gemelli omozigoti, uno dei quali con ME/CFS (l’atro sano), l’enzima ADP/ATP translocasi risulta sotto espresso nel fratello malato, rispetto al fratello sano (Ciregia F et al 2016). Questa ridotta espressione potrebbe essere la causa del complessivo scarso funzionamento dell’enzima nel gruppo HI Blk, oppure potrebbe essere una misura di compenso per il funzionamento eccessivo della traslocazione di ATP fuori dai mitocondri rilevata nel gruppo HI TL_in. Difficile fare ipotesi, ma questa coincidenza è interessante.

Due recenti studi metabolomici hanno apparentemente individuato quelli che sembrano essere due diversi tipi di ME/CFS. In uno è stata descritta una anomalia metabolica caratterizzata da lattato elevato e da un difetto nel ciclo di Krebs (Yamano E, et al. 2016); in un altro invece si è riportato un difetto della glicolisi, con ridotto piruvato e lattato (Armstrong CW et al. 2015). Si potrebbe speculare che i pazienti descritti da Yamano appartengano al gruppo HI Blk, mentre quelli descritti da Armstrong siano del tipo HI LT_in.

Test ergospirometrici eseguiti due giorni di seguito sui pazienti ME/CFS, hanno dimostrato nella prova del secondo giorno che la soglia anaerobica entra precocemente e in definitiva i pazienti consumano meno ossigeno per erogare un watt, rispetto a un soggetto normale (anche sedentario) (Vanness, 2007), (Snell, 2013). Quindi i pazienti farebbero maggiore affidamento sul sistema anaerobico per produrre energia, esattamente come il gruppo HI Blk.

Approfondimenti

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