Introduzione

Nel 2015, uno studio della George Mason University (VA, USA) ha valutato la sensibilità e la specificità -nella malattia di Lyme- di un test che impiega delle particelle appositamente create per intrappolare le eventuali proteine OspA presenti nelle urine dei pazienti. I ricercatori hanno riportato una sensibilità e una specificità del 100% nella Lyme precoce localizzata (EM) e dei dati interessanti anche per la post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS), riesumando l’interesse per la ricerca diretta di antigeni specifici di B. burgdorferi sl nei fluidi biologici dei pazienti (1).

Cenni storici

Negli anni sono stati effettuati alcuni tentativi di rilevamento della proteina di superficie A (OspA) nel liquido cerebrospinale di pazienti con neuroborreliosi. In uno di questi, in particolare, si effettuò la misura dell’OspA nel liquor di 83 individui con vari sintomi neurologici, provenienti da un’area endemica per malattia di Lyme. La misura venne effettuata ‘catturando’ l’OspA per mezzo di un anticorpo antigene-specifico, attraverso il metodo descritto in Figura 1. Si rilevò la presenza della proteina nel 42% dei campioni, dei quali però solo il 57% era sieropositivo per B. burgdorferi sl (2). In un esperimento del 1989, un metodo analogo fu utilizzato per rilevare la presenza di OspA nell’urina di persone con una ben documentata malattia di Lyme. Su dieci pazienti analizzati, tutti sono risultati positivi all’esame, mentre nessuno dei dieci controlli sani dimostrò la presenza di OspA nelle urine (3). Nel complesso, l’affidabilità di questo genere di test è stata tuttavia ritenuta bassa (4).

Il nuovo test

Un test per la ricerca di OspA nelle urine dei pazienti Lyme deve superare tre difficoltà:

  1. la bassa concentrazione di questo antigene nelle urine;
  2. la possibile non specificità dell’anticorpo utilizzato per rilevare l’OspA nei campioni;
  3. la possibile inadeguata sensibilità dell’anticorpo per le OspA delle varie specie patogene di borrelia.

Il gruppo della George Mason University ha risolto il primo ostacolo progettando una particella di diametro nanometrico in gradi di sequestrare le eventuali molecole di OspA presenti nel campione di urine. In questo modo, all’interno della nano-particella si raggiungono concentrazioni elevate dell’antigene. Le altre due difficoltà hanno richiesto un esame approfondito del database di proteine attualmente conosciute, il quale ha portato a identificare la regione che va dall’amminoacido 219 al 253 di OspA, come una regione non omologa a nessun altra proteina di origine umana o di altri agenti infettivi. L’anticorpo utilizzato si lega a questo peptide, quindi riconosce solo l’OspA. Inoltre questo legame richiede la sequenza 236-239 di OspA, la quale è comune alle principali specie patogene di borrelia (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi ss, B. valaisian, B. spielmani, B. bissetti). Tutto questo dovrebbe garantire la specificità e la sensibilità del test.

Risultati

Ebbene, su 24 pazienti con eritema migrante, 24 sono risultati positivi al test; inoltre dei 117 controlli sani nessuno è risultato positivo. Questo depone per una specificità del 100% e per una sensibilità del 100% nella Lyme precoce localizzata. La presenza dell’OspA nelle urine scompare negli individui in cui il trattamento ha avuto successo, evidenziando anche la potenzialità del test di monitorare l’andamento della terapia. Gli autori si sono preoccupati infine di sottoporre all’esame 100 pazienti affetti da PTLDS, riscontrando l’antigene nel 41% dei pazienti, il che proverebbe una infezione attiva in questi soggetti (1).

E i falsi positivi?

Detto questo, è possibile muovere una critica dal punto di vista teorico per quanto riguarda la progettazione del test. Infatti gli Autori hanno identificato l’epitopo specifico dell’OspA solo sulla base delle sequenze di amminoacidi. Questo tipo di analisi non permette di sapere se esistono epitopi conformazionali simili su altre proteine. Pertanto possono esservi regioni di altre proteine rese simili alla sequenza 219-253 di OspA dal ripiegamento della catena peptidica (5). Questi antigeni saranno riconosciuti erroneamente come OspA dal test. Quindi si ha un rischio teorico di falsi positivi che richiede ulteriori approfondimenti.

ricera-ospa
Figura 1. Illustrazione del procedimento usato nei vecchi test per la ricerca diretta di antigeni nei liquidi biologici. Una piastra opportunamente preparata cattura le proteine contenute nel campione (urine o liquor). Quindi un anticorpo specifico per OspA viene aggiunto. In seguito un ulteriore anticorpo (detto secondario) specifico per la regione Fc delle IgG e coniugato a un enzima (in genere l’Horseradish peroxidase) viene inserito. Se l’OspaA è stato catturato sulla piastra, allora l’AC secondario si legherà all’anti-OspA. Un substrato viene quindi aggiunto, il quale emette una specifica radiazione luminosa se entra in contatto con l’enzima dell’anticorpo secondario. Disegno di Paolo Maccallini.

Conclusioni e prospettive

Attualmente i CDC non raccomandano questo test (6), è questo è più che ragionevole, visto che la sua validità è stata dimostrata in un solo studio. È tuttavia previsto il suo impiego nell’ambito di una ricerca sulla ME/CFS presso la Stanford University, affianco ai normali test sierologici per B. burgdorferi sl. Questo e altri studi consentiranno auspicabilmente di accertare se la procedura possa essere considerata o meno affidabile nella diagnostica della malattia di Lyme. L’ingegnere Alessandra Luchini, inventrice delle ‘nanotrappole’, ha raccontato in un incontro presso la George Mason University (7) (vedi sopra) il percorso di vita e di ricerca che ha portato alla messa a punto di questa metodologia e alla sua applicazione in altri ambiti, come quello oncologico.

Riferimenti

  1. Magni, R, et al. Application of Nanotrap technology for high sensitivity measurement of urinary outer surface protein A carboxyl-terminus domain in early stage Lyme borreliosis. Journal of translational medicine. November 2015, Vol. 13, 346.
  2. Coyle, PK, et al. Detection of Borrelia burgdorferi-specific antigen in antibody-negative cerebrospinal fluid in neurologic Lyme disease. Neurology. 1995, Vol. 45, 11.
  3. Hyde, F W, et al. Detection of antigens in urine of mice and humans infected with Borrelia burgdorferi, etiologic agent of Lyme disease. J Clin Microbiol. 1989, Vol. 27, 1.
  4. Aguero-Rosenfeld, ME, et al. Diagnosis of Lyme Borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. July 2005, Vol. 18, 3, p. 484–509.
  5. Morris, GE. Encyclopedia of life sciences. http://www.els.net. [Online] September 2007. [Riportato: 1 Aug 2016.] http://www.els.net/WileyCDA/ElsArticle/refId-a0002624.html.
  6. Centers for disease control and prevention. Laboratory tests that are not recommended. http://www.cdc.gov. [Online] Nov 2015. [Riportato: ]
  7. Luchini, A. Vision Series: Alessandra Luchini – “Nanotechnology in Biomedicine”. GMU-TV . [Online] April 2014.
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