1. Introduzione

In quello che segue riporto alcune note prese durante il simposio sulla ME/CFS tenutosi a Stanford questo 12 agosto, organizzato dalla Open Medicine Foundation. Tutti gli interventi sono disponibili su youtube (R). In questo primo post parlerò esclusivamente di autoanticorpi e auspicabilmente ne seguiranno altri su altri argomenti.

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Figura 1. Sia l’università di Uppsala (sinistra) che la universita dello Utah (destra) confermano la presenza di anticorpi contro i recettori beta adrenergici e contro i recettori muscarinici della acetilcolina.

2. Anticorpi contro i recettori beta adrenergici e muscarinici della acetilcolina

In questo simposio si è avuta una conferma della presenza di anticorpi contro i recettori beta adrenergici e contro i recettori muscarinici della acetilcolina in modo significatimante maggiore nei pazienti ME/CFS, rispetto ai controlli sani (Figura 1). I dati provengono da due gruppi di ricerca distinti, quello di Alan Light (University of Utah) e quello di Jonas Bergquist (Uppsala Universitet). Il riscontro nella ME/CFS di anticorpi contro i recettori muscarinici della acetilcolina fu inizialmente riportato da un gruppo giapponese (Tanaka S et al. 2003) e recentemente da un gruppo norvegese-tedesco (Loebel M etal. 2016), il quale ha anche rilevato – per la prima volta – la presenza di anticorpi contro il recettore beta 2 adrenergico. In particolare, lo studio giapponese trovò un aumento negli anticorpi contro il recettore muscarinico M1 della acetilcolina, mentre quelo successivo evidenziò un aumento negli anticorpi contro i recettori M3 e M4 della acetilcolina (Figura 2). Vale la pena osservare che anticorpi contro i recettori adrenergici beta 1 e 2 e muscarinici M2 e M3 sono stati riscontrati anche nella ipotensione ortostatica (Yu X et al. 2012), (Li H et al. 2012), mentre gli anti-recettore adrenergico beta 2 sono stati rinvenuti nel siero di pazienti con tachicardia posturale ortostatica (Li et al. 2014). Quindi questi stessi autoanticorpi ricorrono nella intolleranza ortostatica, e la intolleranza ortostatica è un sintomo inserito nei criteri diagnostici per la ME/CFS (IOM 2015). Tutto ciò, nel complesso, sembra conferire solidità a questo dato immunitario, e suggerisce che questi autoanticorpi possano avere un ruolo causale in almeno alcuni dei sintomi di un sottogruppo di pazienti. In particolare, alcuni di questi anticorpi hanno dimostrato di interferire con la regolazione fine del diametro dei vasi sanguigni (Li H et al. 2012) e per questo potrebbero teoricamente alterare il flusso di sangue nei muscoli scheletrici e/o nel cervello.

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Figura 2. A sinistra lo studio del 2003, dove si riportò un aumento degli anticorpi contro il recettore muscarinico M1 della acetilcolina nella ME/CFS. A destra lo studio del 2016 in cui si riporta un aumento degli anticorpi contro i recettori muscarinici M3 e M4 della acetilcolina e contro il recettore beta 2 della adrenalina nella ME/CFS.

Non è dato sapere contro quali particolari sottotipi di recettori siano stati trovati autoanticorpi nei due nuovi studi di Light e Bergquist. Tuttavia sappiamo che Bergquist si è premurato di cercarli non solo nel sangue periferico, ma anche nel liquido spinale, trovandoli solo nel primo (figura 1).

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Figura 3. Recettore beta 2 adrenergico. Si osserva l’esposizione extracellulare della coda 1-34, e dei loop 96-106, 175-196, 299-305.

3. Mimetismo molecolare

Non sappiamo perché si generino questi autoanticorpi, ma Light suggerisce che un possibile meccanismo sia rappresentato dal così detto mimetismo molecolare: il sistema immunitario produce un anticorpo contro una proteina di un patogeno – durante una infezione –  ma questa proteina assomiglia a una molecola umana e così – per errore – l’anticorpo si lega all’antigene umano, anche dopo che l’infezione è scomparsa. Questo meccanismo è ritenuto alla base della sindrome di Guillian-Barré a seguito di infezione da Campylobacter jejuni (Van den Berg B et al. 2014). Se consideriamo in particolare il recettore adrenergico beta 2, le regioni che possono essere bersaglio di anticorpi patogenetici sono quelle che dalla membrana cellulare si proiettano verso lo spazio extracellulare (figura 3), ovvero le quattro sequenze di amminoacidi 1-34, 96-106, 175-196, 299-305. Il lettore può verificare da solo, usando il software BLAST offerto dal National Centre for Biotecnology Information (R) che il peptide 2-12 del recettore è simile al peptide 67-77 della proteina sensor histidine kinase MtrB del batterio Pseudonocardia sp. Ae331_Ps2 (R) (figura 4). Questo potrebbe voler dire che – in linea del tutto teorica – un contatto del sistema immunitario con questo batterio potrebbe portare allo sviluppo di anticorpi contro il recettore adrenergico beta 2. Questo è solo un esempio che ho voluto mostrare, per far capire in pratica cosa si intenda per mimetismo molecolare.

molecular mimicry.PNG
Figura 4. Inserendo come query sequence alternativamente i peptidi 1-34, 96-106, 175-196, 299-305 del recettore adrenergico beta 2 in BLAST di NCBI, usando l’algoritmo Quick BLASTP e impostazioni di default (E=100, word di 6 lettere, BLOSUM62 come matrice di sostituzione) si ottiene come unico risultato l’allineamento fra il peptide 2-12 del recettore umano e il peptide 67-77 della proteina sensor histidine kinase MtrB di Pseudonocardia sp. Ae331_Ps2.

4. Non tutti i test sono uguali

E’ importante notare che la misura di anticorpi contro proteine di mebrana (come i recettori) deve essere effettuata incubando il siero dei pazienti con proteine che siano espresse da cellule nella loro posizione fisiologica (cell based assay, CBA). Con l’altra tipologia di test, in cui la proteina è incollata a una piastra, si rischiano tanto falsi positivi (perché la proteina espone al siero regioni che normalmente sarebbero coperte) che falsi negativi (perché la proteina è denaturata e la sua conformazione 3D è alterata). Il vantaggio di un CBA sui test tradizionali è stato dimostrato chiaramente nel caso degli anticorpi anti-MOG (Ramanathan S et al 2016). Bisogna dire che mentre lo studio norvegese-tedesco ha usato la metodologia corretta, quello giapponese del 2003 usò l’altra metodologia e questo forse rende conto della discrepanza dei risultati (figura 2). Non sappiamo che tipo di test abbiano usato Light e Bergquist.

ADRB2_2R4R_231_242
Figura 5. Modello 3D parziale del recettore beta 2 adrenergico (PDB ID: 2R4R, chain A). E’ indicata la posizione relativa alla membrana plasmatica e il peptide 231-242 individuato come possibile epitopo da DiscoTope 2.0. Si vede come questo epitopo è completamente immerso nel citoplasma e quindi non raggiungibile da autoanticorpi in condizioni fisiologiche.

5. Esperimento in silico

Il software DiscoTope 2.0 permette di prevedere tutti i possibili di una proteina contro i quali vengono prodotti anticorpi (regioni dette epitopi). La predizione viene fatta sulla base sia delle caratteristiche geometriche della proteina, che di considerazioni statistiche sulla composizione e topologia degli epitopi noti fino ad oggi (Kringelum, et al., 2012). Se consideriamo in paricolare il recettore beta 2 adrenergico, utilizzando il modello 3D ottenuto sperimentalmente nel 2007 (Rasmussen et al. 2007) e lo sottoponiamo al software DiscoTope 2.0, si ottiene come unico possibile epitopo il peptide 231-241, il quale tuttavia si trova immerso nel citoplasma (figura 5) e quindi, in condizioni fisiologiche, non potrebbe mai costituire un bersaglio per anticorpi. Tuttavia, in un test di tipo ELISA in cui il recettore beta 2 adrenergico è incollato a una piastra e viene esposto al siero, si potrebbero verificare dei falsi positivi dovuti alla reazione del siero dei pazienti contro l’epitopo 231-241.

 

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