Il cavallo marino e l’energia

Il cavallo marino e l’energia

Le misure metaboliche in vitro dello studio norvegese  in cui fu evidenziato un possibile blocco al livello del piruvato deidrogenasi nei pazienti ME/CFS, sono state effettuate con il dispositivo Seahorse XFe96 della Agilent. Questo apparecchio (grande come una stampante da tavolo) permette di misurare in tempo reale – in vitro – il metabolismo energetico di cellule prelevate da pazienti (ad esempio linfociti). Come è spiegato nel video che segue, il tutto si riduce a due misure:

  1. una misura del consumo di ossigeno, che fornisce una stima del funzionamento mitocondriale;
  2. una misura della concentrazione di protoni, che fornisce una stima del funzionamento della glicolisi.

Mi risulta che l’Università degli Studi di Firenze sia in possesso di questo apparecchio (vedi qui).

Il Seahorse è attualmente impiegato nello studio di Avindra Nath (NIH) su 40 pazienti con ME/CFS post-infettiva (PI-ME/CFS). Come gruppo di controllo per questa ricerca, oltre a 20 persone sane, sono state selezionate anche 20 persone che hanno avuto la Lyme e sono completamente guarite.

seahorse

Western blot per malattia di Lyme

Western blot per malattia di Lyme

Senza entrare nei dettagli, è utile sapere che l’immunoblot (o western blot) è una procedura che consente di determinare contemporaneamente la presenza, nel sangue analizzato, di anticorpi contro più antigeni del patogeno. Una rassegna di questi antigeni si trova qui. Gli antigeni sono disposti su un supporto, divisi in fasce trasversali (dette bande) contigue ma separate, mentre l’esecuzione del test non è dissimile da quella descritta per il test ELISA. In Figura 1 e in Figura 2 sono rappresentati i supporti (IgM e IgG, rispettivamente) per un western blot attualmente in commercio in Europa (Euroimmun).

IB IgM
Figura 1. Rappresentazione di un western blot europeo per IgM. Disegno di Paolo Maccallini.
IB IgG
Figura 2. Rappresentazione di un western blot europeo per IgG. Disegno di Paolo Maccallini.

Affinché un western blot (in IgM o in IgG) sia considerato positivo, non è necessario che tutte le bande lo siano, sono sufficienti solo alcune bande positive. Il numero e il tipo di bande positive affinché un western blot sia positivo è stato determinato con considerazioni statistiche in modo da garantire la massima specificità del test, determinando dei criteri validi per l’area europea. Tali criteri sono riportati in Tabella 1, dove sono posti a confronto con i criteri adottati negli Stati Uniti (CDC, 1995). Come si vede i criteri europei richiedono la positività a un minor numero di bande, essendo la risposta immunologica dei pazienti affetti da borrelia europea ristretta a un numero inferiore di proteine di superficie (Wilske B et al. 2007). In Tabella 2 e Tabella 3 sono riportate sensibilità e specificità per un western blot tedesco attualmente in uso, interpretato con criteri europei (Branda JA et al. 2013). Nella prima tabella le IgM e le IgG sono considerate separatamente, mentre nella seconda si considera un test positivo se positivo in almeno una delle due classi di anticorpi. Dalla Tabella 3 si può notare come, ad esempio, un western blot negativo sia un falso negativo nel 13% di casi neuroborreliosi, così come un test positivo sarà un falso positivo nel 9% di casi di neuroborreliosi o artrite di Lyme.

criteri IB
Tabella 1. Criteri per l’interpretazione del western blot in Europa e in USA. Tabella di Paolo Maccallini.
sensibilità specificità 1
Tabella 2. Sono riportati sensibilità e specificità per un western blot europeo. EM sta per eritema migrante, NB per neuroborreliosi, ACA per acrodermatite cronica atrofica. IgG e IgM sono considerate separatamente. Tabella di Paolo Maccallini.
sensibilità specificità 2
Tabella 3. Sono riportati sensibilità e specificità per un western blot europeo. EM sta per eritema migrante, NB per neuroborreliosi, ACA per acrodermatite cronica atrofica. IgG e IgM sono considerate insieme. Tabella di Paolo Maccallini.

Reclutamento pazienti Lyme

Reclutamento pazienti Lyme

Mi è stata segnalata una iniziativa – di cui non so molto per la verità – ma che sembra interessante e potenzialmente utile. Per questo riporto qui – così come mi è stato girato – il seguente messaggio, rivolto a tutti i pazienti a cui sia stato assegnato il codice di esenzione per patologia RA0030, associato alla Malattia di Lyme. Per ulteriori informazioni ci si rivolga a Laly Reghenzani (+39 3400549577).

!! AAA – RA0030 – AAA !!

E’ stato creato attorno a questa patologia, la Malattia di Lyme, un nuovo gruppo di ricerca scientifica: si cercano pertanto pazienti con certificazione statale di tale infermità per dare vita, tramite loro, a un database su sintomi, terapie ed esami effettuati. Professori universitari di varie discipline e istituti offriranno il loro contributo professionale e visiteranno senza fini di lucro, per inquadrare il più possibile sintomi, diagnostica e terapizzazioni di questa malattia plurimorfa; l’obiettivo è quello di fissare approcci e metodiche nuove di intervento e assistenza, consulenza e terapizzazione di chi ne sia affetto.

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* Cercasi persone con Malattia di Lyme certificata RA0030 *
Aderisci o diffondi la notizia a chi sai può esserne interessato.
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Questo è il punto di partenza di un progetto inedito per l’Italia, multisettoriale, e che si auspica possa conoscere nuovi percorsi di assistenza e tutela dei malati. Il focus di indagine sarà in una seconda fase ampliato anche a coloro che non possiedono una diagnosi acclarata di tale patologia. Più persone vorranno far parte già agli esordi di questo programma, più ampio e rapido sarà l’itinere di tale planning.

Fate pertanto avere avere a me, Stefano Richichi, o Laura (Laly Reghenzani) il vostro nome, indirizzo e recapiti vari: così  verrete contattati quanto prma per ricevere ulteriori dettagli. Le visite si cercherà di effettuarle raccorpate fra vari specialisti, per essere di minor incomodo a chi dovesse spostarsi per effettuarle.

Sia il benvenuto a chi è interessato, grazie dell’attenzione

Dapsone? Parliamone

Dapsone? Parliamone

Il dapsone, proposto recentemente come una terapia per le forme persistenti di Borrelia burgdorferi (Horowitz R et al. 2016), in realtà non risulta più efficace della cefuroxima o della doxiciclina, secondo degli esperimenti in vitro del gruppo di Zhang (Feng J et al. 2017) (vedi tabella sotto). Quindi non esisterebbe un vantaggio nell’uso del dapsone al posto dei farmaci comunemente usati nella malattia di Lyme da alcuni decenni, ovvero doxiciclina e cefalosporine. Bisogna dire però che si sta parlando di studi in vitro.

dapsone.png

Come accennato sopra, Horowitz e colleghi hanno tuttavia riportato un beneficio in 100 pazienti cronici (post-treatment Lyme disease syndrome) trattati con dapsone associato a vari altri farmaci. Lo studio non è in doppio cieco e il trattamento non è lo stesso per ciascun paziente. Quindi è difficile trarre delle conclusioni sulla importanza del risultato. Inoltre il miglioramento sembra modesto: se consideriamo la fatica pre e post trattamento, ad esempio, si ha un miglioramento dell’11% nella scala adottata (vedi tabella sottostante). Sembrerebbe un effetto irrisorio, sovrapponibile forse ad un effetto placebo.

dapsone 2.png

Così, mentre le università di Stanford, John Hopkins, e Northeastern si affannano a cercare farmaci che possano superare il limite delle terapie attuali (vedi questo articolo ad esempio), Richard Horowitz propone come ultima frontiera delle cure anti-Borrelia un farmaco che non è più efficace di quelli in uso da alcuni decenni. E’ vero, Horowitz non ha dato fino ad ora nessun contributo significativo alla ricerca sulla malattia di Lyme, però lascia ai posteri una spassosa canzoncina su questo spietato male (vedi sotto). So che è la disperazione ad accecare le capacità di giudizio dei pazienti, che da tutto il mondo finiscono nello studio di Horowitz, e lo capisco. Quello che dispiace è che esista chi cerca di fare affari su questa disperazione.

Kim Lewis e il disulfiram

Il farmaco di cui parla Kim Lewis qui – senza volerlo norminare nonostante l’insistenza della intervistatrice – è con buona probabilità il disulfiram, sostanza di cui Kim Lewis ha parlato in altre circostanze. Chi avesse la pazienza di vedere il video, lo faccia. Proverò magari a sintetizzare (o sottotitolare il video) in seguito. Ma ho parlato di questa ricerca in questo articolo.

Da notare che chi – come Kim Lewis – si occupa della ricerca sui sintomi cronici della malattia di Lyme, ammette di non sapere a cosa siano dovuti; e conduce studi proprio per scoprirlo. Chi afferma in modo categorico di conoscere cosa sia la Lyme cronica, con quali test identificarla, e come curarla in genere deve vendere qualcosa.

Anti-neuronal autoimmunity in Lyme disease

Anti-neuronal autoimmunity in Lyme disease

Introduction

Neurological sequelae of chronic Lyme disease include encephalopathy, myelopathy and peripheral neuropathy. These have generally been attributed to either persistent infection or pathogen-induced autoimmunity (IOM, Institute of Medicine, 2011).

Anti-HSP60 antibodies

In 1988, Sigal et al. found that sera from patients with neurological manifestations of Lyme disease had IgM antibodies that bound to normal human axons, whereas binding was absent or weak in patients without neurologic findings (Sigal, et al., 1988). In 1993, Dai et al. proved that a monoclonal antibody (H9724) specific for the 41-kDa flagellar protein of Borrelia burgdorferi, cross-reacted with human axons. The cross-reacting protein was identified as chaperonin-HSP60 (Dai, et al., 1993). It was also proven in the same year, that human sera from Lyme patients which bound to human axons, also bound to HSP60 (Sigal, 1993). In 2001, evidence was provided that addition of H9724 to neuroblastoma cell cultures blocks in vitro spontaneous and peptide growth-factor-stimulated neuritogenesis. It was reported that H9724 bound to an intracellular target in cultured cells with negligible, if any, surface binding (Sigal, et al., 2001).

Neuroborreliosis Garia-Monco et al, October 1995 (Garcia-Monco, et al., 1995)
Method Antigen Standard. Primary and secondary Ab Secondary antibody,

substrate

Results
ELISA

indirect

Gangliosides (CM, asialo-GM1, GM1) Rabit antisera to asialo-GM1 and GM1,

Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabit Ig (polyvalent)

Horseradish peroxidase-conjugated anti-rat IgM Rats immunized with borrelia non-protein antigens showed sera reactivity against gangliosides, and rats immunized with gangliosides showed reactivity against borrelia antigens. Borrelia antigens elicited mainly an IgM response.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rat IgG

Anti-ganglioside antibodies

In European studies, a marked IgM reactivity to ganglioside GM1 in the cerebrospinal fluid of neuroborreliosis patients has been reported  (Weller, et al., 1992). In a 1993 study, 29% of patients with neuroborreliosis and 59% of patients with syphilis had IgM reactivity to gangliosides with a Gal (beta 1-3) GalNac terminal sequence (GM1, GD1b, and asialo-GM1). Given the clinical associations of patients with neuroborreliosis and syphilis with IgM reactivity to gangliosides sharing the Gal (beta 1-3) GalNac terminus, the authors suggested that these antibodies could represent a response to injury in neurological disease or a cross reactive event caused by spirochetes (García-Moncó, et al., 1993). In 1995, the molecular mimicry hypothesis was investigated by the same research group. They found that immunization of mice with nonprotein Borrelia burgdorferi antigens induced high levels of IgM antibodies to asialo-GM1 and GM1. Moreover, immunization with asialo-GM1 cross-reacted with antigenic determinants present in B. burgdorferi. These experimental results are consistent with the hypothesis of a microbial origin for some of these potentially autoreactive antibodies. This situation is analogous to the induction of antibodies to GM1 after infection with Campylobacter jejuni, where the origin of cross-reactivity has been attributed to the LPS of this bacterium, which carries sugar sequences similar or identical to those in ganglioside GM1. The predominance of IgM antibodies in rats immunized with nonprotein Borrelia burgdorferi antigens in the recognition of asialo-GM1 and GM1 suggests a T-cell-indipendent mechanism for development of these antibodies. This would be consistent with the T-cell-indipendent genesis of antibodies to LPS and to carbohydrates in general (Garcia-Monco, et al., 1995). In Table 1 I have reported some experimental settings for this study.

Anti-cardiolipine antibodies

Anti-cardiolipin antibodies may occur in patients with Lyme disease, particularly in those with neurologic abnormalities. The IgM serotype was found in 7/28 serum samples while the IgG serotype was found to be positive in 4/28 serum samples. Higher IgM anti-CA positivity tended to be associated with neurologic diseases (Mackworth-Young, et al., 1988). In another study, anti-CA antibodies of the IgG serotype were found in 50% of patients with neuroborreliosis (García-Moncó, et al., 1993). On anti-cardiolipin antibodies please see also this post.

Anti-neuronal antibodies

In 2005, antibodies against two of the OspA peptides were found to react with neurons in human brain, spinal cord and dorsal root ganglia (DRG) by immunohistochemistry (Alaedini, et al., 2005). In 2010 anti-neural antibodies reactivity was seen in serum specimens from 41 of 83 (49,4%) Lyme patients with chronic complaints, both seropositive and seronegative. Serum antibodies from those patients were found to be positive for anti-neuronal antibody reactivity by immunoblotting stained cortical pyramidal neurons, as well as neurons of DRG. Antibody binding to some glial cells of the brain and DRG was also observed (Chandra, et al., 2010). The same test was performed on 51 ME/CFS patients and no significant difference in the prevalence of anti-neuronal antibody reactivity was found, in comparison with healthy controls (Ajamian, et al., 2015). In a 2013 study, it was observed that nearly half of the patients enrolled, who had a history of Lyme disease and persistent cognitive symptoms, showed increased serum antibody reactivity to neuronal antigens (Jacek, et al., 2013).

Autoimmunità nella malattia di Lyme

Autoimmunità nella malattia di Lyme

Introduzione

Le sequele neurologiche della malattia di Lyme includono deficit cognitivi più o meno severi (che complessivamente prendono il nome di encefalopatia di Lyme) e varie forme di mielopatie e/o neuropatie periferiche. Nel complesso questi disturbi non rispondono alle cure antibiotiche attualmente in uso e non è chiaro se siano da attribuire a una persistenza dell’agente infettivo, a danni al tessuto nervoso, oppure a patologie immunitarie indotte dalla infezione (IOM, Institute of Medicine, 2011). In quello che segue propongo una mia revisione della letteratura (sicuramente incompleta) sulla autoimmunità nella malattia di Lyme.

La saga degli anticorpi anti-HSP60

Nel 1988, Sigal e colleghi trovarono che i sieri dei pazienti Lyme con sintomi neurologici presentavano IgM che si legavano ad assoni umani. Questo tipo di cross reattività era assente nel siero di pazienti Lyme privi di sintomi neurologici (Sigal, et al., 1988). Nel 1993, Dai et al. dimostrarono che un anticorpo monoclonale (H9724) specifico per la flagellina p-41 di Borrelia burgdorferi, cross-reagiva con assoni umani. In particolare, fu possibile identificare l’autoantigene che risultò essere la proteina HSP60 (Dai, et al., 1993). Nel medesimo anno fu verificato che il siero di pazienti con malattia di Lyme che cross-reagiva con gli assoni umani, si legava proprio alla proteina HSP60 (Sigal, 1993). Alcuni anni dopo, lo stesso gruppo di ricerca fu in grado di provare che l’anticorpo H9724 veniva di fatto internalizzato dalle cellule bersaglio, finendo per legarsi a un antigene intracellulare (Sigal, et al., 2001). Gli autori suggerirono che gli anti-HSP60 indotti dalla risposta immunitaria conto la flagellina p-41 – per mimetismo molecolare – abbiano un ruolo causale nella neuropatia periferica della malattia di Lyme.

Gli anti-gangliosidi

Nel liquido spinale di pazienti europei con neuroborreliosi è stata riportata una marcata risposta umorale contro il ganglioside GM1, tanto in IgM che in IgG (Weller, et al., 1992). In uno studio del 1993, il 29% dei pazienti con neuroborreliosi e il 59% dei pazienti con sifilide presentava una reattività in IgM contro i gangliosidi GM1, GD1b, e asialo-GM1. Questi autoanticorpi furono interpretati dagli autori o come una risposta a un danno del sistema nervoso prodotto dalla infezione, oppure come autoanticorpi prodotti per mimetismo molecolare a partire dalla risposta immunitaria sviluppata in origine contro l’agente patogeno (García-Moncó, et al., 1993). Nel 1995 lo stesso gruppo di ricerca fece un esperimento: indusse una risposta immunitaria contro antigeni non proteici di B. burgdorferi nei topi, e verificò che si sviluppavano IgM contro gli auto-antigeni asialo-GM1 e GM1. Viceversa, immunizzando i topi contro l’antigene asialo-GM1, induceva anticorpi contro B. burgdorferi. Questi risultati sperimentali furono interpretati come coerenti con una ipotesi di autoimmunità contro i gangliosidi indotta per mimetismo molecolare da antigeni non proteici di B. burgdorferi (Garcia-Monco, et al., 1995). Questa situazione è analoga a quella degli anticorpi anti-GM1 indotti da infezione da Campylobacter jejuni, dove l’origine della cross-reattività è stata ricondotta ai lipopolisaccaridi (LPS) del battere, i quali presentano porzioni molecolari simili o identiche a quelle del ganglioside GM1. Si può osservare che la predominanza di anticorpi del tipo IgM suggerisce una loro sintesi indipendente dale cellule T, la qual cosa è del tutto coerente con il fatto che anticorpi contro antigeni non proteici sono spesso generati senza l’intervento delle cellule T. Gli anticorpi anti-gangliosidi sono comunemente associati a danni al sistema nervoso periferico.

Gli anti-cardiolipina

Anticorpi anti-cardiolipina sono stati riscontrati nei pazienti con malattia di Lyme, in particolar modo in quelli con problemi neurologici. In uno studio del 1988, 7/28 pazienti presentavano anti-cardiolipina del sierotipo IgM, mentre 4/28 presentavano anticorpi conto la cardiolipina del sierotipo IgG. I titoli più alti erano associati a sofferenze neurologiche maggiori (Mackworth-Young, et al., 1988). In un altro studio il 50% dei pazienti con neuroborreliosi presentava anticorpi del sierotipo IgG contro la cardiolipina (García-Moncó, et al., 1993). Gli anticorpi anti-cardiolipina reagiscono contro antigeni del sistema nervoso centrale (i fosfolipidi cefalina e sfingomielina) (Harris, EN, et al. 1984) e quindi – teoricamente – potrebbero essere legati causalmente ai disturbi cognitivi della encefalopatia di Lyme.

Gli anti-OspA e l’autoimmunità contro il cervello

Nel 2005, anticorpi contro la proteina di superficie A (OspA) di B. burgdorferi risultarono cross-reattivi con neuroni umani del cervello, del midollo spinale e dei gangli dorsali (Alaedini, et al., 2005). Nel 2010, anticorpi contro il sistema nervoso centrale furono rilevati in 41 su 83 (49,4%) pazienti Lyme con sintomi cronici, tanto sieropositivi che sieronegativi. Il siero dei pazienti conteneva anticorpi che attaccavano neuroni piramidali corticali  e neuroni dei gangli dorsali (Chandra, et al., 2010). Nel 2013 fu osservato che circa metà dei pazienti con sintomi cronici della malattia di Lyme e disfunzioni cognitive, presentavano anticorpi reattivi contro tessuti del sistema nervoso centrale (Jacek, et al., 2013).

La ME/CFS è diversa

Vale la pena osservare che il gruppo di Chandra ripetè lo stesso tipo di esame – per la ricerca di anticorpi anti-SNC – anche in 51 pazienti ME/CFS e scoprì che in questo caso non si riscontrava la presenza di attività del sistema immunitario contro il cervello (Ajamian, et al., 2015). Veniva così confermata una osservazione analoga di decenni addietro (Buchward D et al. 1991). Questo risultato potrebbe giustificare l’osservazione di alcuni autori secondo i quali le disfunzioni cognitive dei pazienti post-Lyme siano mediamente peggiori di quelle dei pazienti ME/CFS (Gaudino, 1997).

E le cellule T?

L’autoimmunità da autoanticorpi è solo metà della mela, quando si parla di autoimmunità. L’altra metà è rappresentata dalle cellule T autoreattive. Vale la pena osservare qui che in presenza di autoanticorpi è bene sospettare anche la presenza di cellule Th autoreattive, questo in virtù del meccanismo di attivazione delle cellule B. Ciò detto, alcuni studi suggeriscono la presenza di cellule T CD4+ che attaccano il sistema nervoso centrale, tanto nella Lyme acuta (Lünemann, et al., 2007), che in quela cronica (Martin, et al., 1988).

E allora?

Così come gli anticorpi contro un agente infettivo possono rimanare per anni o decenni, dopo che l’agente infettivo è stato sconfitto, allo stesso modo eventuali autoanticorpi indotti per errore durante la risposta immunitaria alla malattia di Lyme, potrebbero durare per alcuni anni (o per sempre) dopo che l’agente infettivo è scomparso. E’ difficile dire quale ruolo abbiano gli autoanticorpi e le cellule T autoreattive nella malattia di Lyme, ma è plausibile che siano responsabili – almeno in alcuni casi – dei sintomi cronici della malattia, e della mancata risposta agli antibiotici.