Coltura di B. burgdorferi e persistenza

Coltura di B. burgdorferi e persistenza

Introduzione

Il fenomeno della persistenza batterica è noto sin dal 1944, quando Joseph Bigger osservò che le colture di streptococco esposte alla penicillina, ospitavano una piccolissima percetuale di batteri sopravvissuti, caratterizzati dalle seguenti tre proprietà:

  1. un metabolismo rallentato, con bassissima velocità di replicazione;
  2. la capacità di replicarsi di nuovo, se posti in condizioni ottimali (terreno di coltura adguato, assenza di antibiotici);
  3. conservata suscettibilità agli agenti antimicrobici (Bigger WB. 1944).

La terza proprietà – in particolare – distingue i batteri persistenti da quelli resistenti, i quali sono caratterizzati da una invulnerabilità su base genetica nei confronti dgli agenti antimicrobici. Da Bigger in poi, il fenomeno della persistenza è stato descritto in molte specie batteriche, compresa Borrelia burgdorferi, sebbene il meccanismo alla sua base rimanga misterioso (Lewis K. 2000), (Zhang Y. 2014). Le forme persistenti di Borrelia burgdorferi sono state chiamate in causa come possibile origine di alcuni casi di post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS).

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Figura 1. La fase di crescita dura 5-6 giorni. Quindi il numero di esemplari nella colonia diventa costante. Da (Feng J et al. 2014).

Fase di crescita e fase stazionaria

Gli studi di cui sopra utilizzano colture di B. burgdorferi (ceppo B31) cresciuta su terreno di Barbour-Stoner-Kelly (BSK), in incubatore microaerofilo, a 33°C e 5% di CO2. In questo tipo di coltura i batteri vanno incontro a due fasi successive di crescita (vedi figura 1):

  1. Log phase (fase di crescita), dura 5 giorni ed è un periodo in cui i batteri aumentano rapidamente di numero, per mitosi. In questa fase le forme persistenti costituiscono solo una piccola percentuale della colonia.
  2. Stationary phase (fase stazionaria), dal 5-6° giorno in poi i batteri rallentano il metabolismo, e il numero di individui della colonia si mantiene stabile. In questa fase aumenta il numero di batteri con fenotipo persistente. Si cominciano a formare anche microcolonie di batteri in contatto fra di loro, in alcuni casi tenuti insieme da una rete di polimeri (biofilm).
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Lyme a Roma

Lyme a Roma

La legge di Ginsberg

Volendo stimare il rischio di contrarre uno degli agenti patogeni trasmessi da Ixodes ricinus, si indichi con n il numero di morsi ricevuti da parte dell’Ixodes e con k la percentuale di zecche portatrici di quel particolare agente patogeno. Allora la probabilità p di contrarre il patogeno dopo n morsi è data dalla formula qui riportata (Ginsberg, 1993):

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Questo risultato si ricava immediatamente se si considera che la probabilità di essere morso da n zecche tutte non infette è pari a

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Dunque quella di essere morso da almeno una zecca infetta è appunto uno meno tale quantità.

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Tabella. Percentuale delle zecce portatrici di varie infezioni nella riserva naturale Insugherata (Mancini, et al. 2014).

Lyme a Roma

Volendo ora applicare questa formula in un contesto reale, consideriamo la riserva naturalistica dell’Insugherata, una vasta area verde che si estende nella zona nord di Roma, all’interno del Municipio XV. In tabella riporto alcuni dati statistici relativi alla popolazione di Ixodes ricinus di questa regione (Mancini, et al., 2014). Supponiamo ora che un abitante di Roma frequenti regolarmente in estate questa località, diciamo per 10 anni; supponiamo inoltre che questa persona ami fare escursioni, e per questo trascorra la maggior parte del suo tempo a contatto con la natura. Ammettiamo allora che sia complessivamente stato morso da tre Ixodes ricinus nel corso di questi 10 anni. La probabilità di essere stato morso da una zecca portatrice di uno qualunque degli agenti patogeni in tabella, è data da

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Ovvero si ha quasi la certezza che il nostro soggetto sia stato morso da un Ixodes infetto. Se consideriamo invece solo la probabilità di essere stato morso da una zecca portatrice di Borrelia, si ottiene

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Se ci chiediamo ancora che probabilità vi siano che si venga morsi da un Ixodes che sia portatore contemporaneamente -ad esempio- di Borrelia e di Rickettsia, si calcola facilmente che tale valore è dato da

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Rischio di trasmissione

Come si vede si tratta di probabilità molto significative. A questo punto tuttavia è necessario precisare che nel caso in cui si venga morsi da una zecca infetta e questa abbia modo di inoculare il suo carico patogeno, il nostro sistema immunitario non rimane indifferente e comincia ad aggredire l’invasore (Sompayrac, 2012). Ciò significa che solo una parte dei batteri inoculati sopravvive, ed è dunque in grado di dar luogo a una infezione sintomatica. In particolare, nel caso della Borrelia, si stima che, assunta una percentuale di I. ricinus infetti del 20 – 40%, allora la probabilità che il morso dia luogo a una borreliosi è solo del 1-2% (Trevisan, et al., 2015). Utilizzando questa stima, la probabilità p di contrarre il patogeno dopo n morsi e di sviluppare una infezione sintomatica diviene

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Applicando questa formula al caso del nostro esempio, abbiamo che la sua probabilità di contrarre una infezione sintomatica (e potenzialmente cronica) da Borrelia, scende drasticamente a 3%. Se estendiamo poi questo modello alle coinfezioni, la probabilità di contrarre una infezione sintomatica di uno qualunque degli agenti patogeni menzionati, nel presente esempio, è del 13%.

Bibliografia

Ginsberg, HS. 1993. Transmission risk of Lyme disease and implications for tick managment. American Journal of Epidemiology. 1 July 1993, Vol. 138, 1, p. 65-73.

Mancini, Fabiola, et al. 2014. Prevalence of tick-borne pathogens in an urban park in Rome, Italy. Annals of Agricoltural and Enviromental Medicine. 2014, Vol. 21, 4, p. 723-727.

Sompayrac, Lauren M. 2012. How the Immune System Works. Fourth Edition. s.l. : Wiley-Blackwell, 2012.

Trevisan, G, et al. 2015. Borreliosi di Lyme. [aut. libro] Mario Pippione. Dermatologia e malattie sessualmente trasmissibili. Terza edizione. Torino : Edizioni Minerva Medica, 2015, p. 113-119.

Proteine immunogeniche di B. burgdorferi

Proteine immunogeniche di B. burgdorferi

Di Paolo Maccallini

In tabella propongo una rassegna delle principali proteine di superficie di Borrelia burgdorferi sl note per indurre una risposta anticorpale negli esseri umani (proteine immunogeniche, come si dice). Per ciascuna di esse è riportato il peso in kDa (1Da=1/12 della massa del C-12), la sigla identificativa e una breve descrizione. Sulla destra si ha la sensibilità degli anticorpi IgM e IgG contro ciascuna di queste proteine, in vari stadi della malattia di Lyme.

Risposta immunitaria
Tabella.  Le principali proteine immunogeniche di Borrelia burgdorferi sl sono riportate in ordine crescente di peso. In grigio i dati relativi alla popolazione del Nord Amercica, gli altri dati sono sulla popolazione europea. Si noti la persistenza della risposta in IgM alla OspC nella fase tardiva della malattia.

 I dati per BmpA, BmpB e BmpD sono presi da (Bryksin AV et al, 2005). I dati per OspA e OspB sono presi da (Akin E et al. 1999)  (per la fase EM) e da (Chandra A et al 2011) (per la fase tardiva). Gli altri dati sono tatti da (Aguero-Rosenfeld ME et al 2005). I valori evidenziati in grigio sono relativi alla popolazione del Nord America, gli altri competono alla popolazione europea.

Parete 3
Figura. Parete cellulare di Borrelia burgdorferi sl. Da Medical Biology, di Milton S e Baron S (1996), con modifiche. Disegno di Paolo Maccallini.

 Nella figura ho rappresentato schematicamente la parete cellulare di B. burgdorferi. Si può apprezzare la collocazione delle proteine di superficie nel doppio strato fosfolipidico della membrana esterna (Milton, S; Kwang-Shin, K. Medical Microbiology, 1996). Ho inoltre riportato le principali misure degli elementi anatomici salienti. Si noti la collocazione dello strato peptidoglicano, fra i due doppi strati fosfolipidici. Lo strato peptidoglicano ha una importante funzione di sostegno meccanico della parete cellulare e la sua sintesi è ostacolata dagli antibiotici del gruppo dei betalattamici.

Volume di Borrelia burgdorferi

Volume di Borrelia burgdorferi

“Non ho mai smesso di cercare il segreto della forma.”

Le Corbusier

E’ stato dimostrata in vitro la capacità della spirocheta Borrelia burgdorferi di penetrare e vivere all’interno di cellule umane di tipo endoteliale (Ma Y et al. 1991) e neuronale (Livengood JA et al. 2006) e questa prerogativa è stata chiamata in causa come possibile meccanismo alla base della evasione del sistema immunitario e di perpetuazione dei sintomi nei soggetti già trattati secondo le raccomandazioni ufficiali (Donta ST, 2012). E’ possibile che un requisito fondamentale per una sopravvivenza intracellulare sia un volume modesto.

Altra caratteristica interessante di Borrelia burgdorferi è la sua capacità di passare dal fenotipo a spirocheta a un fenotipo sferico con un volume molto maggiore (round body, RB), sia in vivo che in vitro (Miklossy J et al. 2008). Come si vede dalla tabella sottostante (Maccallini P, 2016), il passaggio da spirocheta a RB comporta un notevole aumento di volume con un contestuale crollo del rapporto superficie/volume. Una possibile giustificazione per questa drastica trasformazione potrebbe essere il tentativo da parte di B. burgdorferi di diminuire gli scambi con l’esterno e rallentare il metabolismo, in modo da acquisire una forma di refrattarietà ai trattamenti antibiotici.

volume

Ulteriori considerazioni e la derivazione matematica di questi dati, sono disponibili nella già citata fonte (Maccallini P, 2016). Il volume e la superficie del batterio nel suo fenotipo a spirocheta con svliluppo a sinusoide piana sono stati calcolati in base alle misure riportate nella figura seguente.

Lunghezza d'onda
Misure relative a una lunghezza d’onda del fenotipo con sviluppo a sinusoide piana del batterio B. burgdorferi sl. Disegno di Paolo Maccallini.

Borrelia mayonii

Borrelia mayonii

Una nuova specie patogena di borrelia è stata scoperta negli USA, in base alla identificazione di differenze nel gene oppA1. I pazienti in cui è stata trovata sono 6 su circa cento mila, e provengono esclusivamente dall’upper midwest (vedi figura). L’organismo -battezzato Borrelia mayonii (in onore del fondatore della prestigiosa organizzazione no-profit Mayo Clinic, William Mayo)- è stato rinvenuto anche in un esiguo numero di Ixodes scapularis, dalla stessa regione geografica (Pritt, 2016).

La cosa interessante è che, sebbene l’organismo produca gli stessi anticorpi che vengono rilevati dai comuni test sierologici, i sintomi che induce nell’uomo sono leggermente diversi da quelli di Borrelia burgdorferi, con presenza di nausea e mal di testa e con un tipo di rash cutaneo diverso da quello ‘a occhio di bue’. Si tratta di un rash diffuso, che dunque non viene riconosciuto dal medico come manifestazione della malattia di Lyme.

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Upper Midwest

Altra osservazione è che come negli Stiati Uniti, anche in Europa potrebbero esservi specie del tutto sconosciute di Borrelia, con sintomi non comunemente associati alla malattia di Lyme, che attendono di essere catturate dall’occhio scrupoloso della nuova generazione di ricercatori, nascoste negli intestini dei vettori, o nei gangli dorsali dei pazienti. In effetti, dalla mappa (vedi figura) si potrebbe pensare che gli antenati di questa borrelia siano venuti dal vecchio continente, magari in tempi più recenti rispetto alle altre specie, attraverso lo stretto di Bering. In questo caso potremmo avere anche noi questa specie, o una affine.

La dr.ssa Pritt ha rilasciato anche una intervista video su questa scoperta.