Western blot per malattia di Lyme

Western blot per malattia di Lyme

Senza entrare nei dettagli, è utile sapere che l’immunoblot (o western blot) è una procedura che consente di determinare contemporaneamente la presenza, nel sangue analizzato, di anticorpi contro più antigeni del patogeno. Una rassegna di questi antigeni si trova qui. Gli antigeni sono disposti su un supporto, divisi in fasce trasversali (dette bande) contigue ma separate, mentre l’esecuzione del test non è dissimile da quella descritta per il test ELISA. In Figura 1 e in Figura 2 sono rappresentati i supporti (IgM e IgG, rispettivamente) per un western blot attualmente in commercio in Europa (Euroimmun).

IB IgM
Figura 1. Rappresentazione di un western blot europeo per IgM. Disegno di Paolo Maccallini.
IB IgG
Figura 2. Rappresentazione di un western blot europeo per IgG. Disegno di Paolo Maccallini.

Affinché un western blot (in IgM o in IgG) sia considerato positivo, non è necessario che tutte le bande lo siano, sono sufficienti solo alcune bande positive. Il numero e il tipo di bande positive affinché un western blot sia positivo è stato determinato con considerazioni statistiche in modo da garantire la massima specificità del test, determinando dei criteri validi per l’area europea. Tali criteri sono riportati in Tabella 1, dove sono posti a confronto con i criteri adottati negli Stati Uniti (CDC, 1995). Come si vede i criteri europei richiedono la positività a un minor numero di bande, essendo la risposta immunologica dei pazienti affetti da borrelia europea ristretta a un numero inferiore di proteine di superficie (Wilske B et al. 2007). In Tabella 2 e Tabella 3 sono riportate sensibilità e specificità per un western blot tedesco attualmente in uso, interpretato con criteri europei (Branda JA et al. 2013). Nella prima tabella le IgM e le IgG sono considerate separatamente, mentre nella seconda si considera un test positivo se positivo in almeno una delle due classi di anticorpi. Dalla Tabella 3 si può notare come, ad esempio, un western blot negativo sia un falso negativo nel 13% di casi neuroborreliosi, così come un test positivo sarà un falso positivo nel 9% di casi di neuroborreliosi o artrite di Lyme.

criteri IB
Tabella 1. Criteri per l’interpretazione del western blot in Europa e in USA. Tabella di Paolo Maccallini.
sensibilità specificità 1
Tabella 2. Sono riportati sensibilità e specificità per un western blot europeo. EM sta per eritema migrante, NB per neuroborreliosi, ACA per acrodermatite cronica atrofica. IgG e IgM sono considerate separatamente. Tabella di Paolo Maccallini.
sensibilità specificità 2
Tabella 3. Sono riportati sensibilità e specificità per un western blot europeo. EM sta per eritema migrante, NB per neuroborreliosi, ACA per acrodermatite cronica atrofica. IgG e IgM sono considerate insieme. Tabella di Paolo Maccallini.

Risonanza magnetica spettroscopica e neuroinfiammazione

Risonanza magnetica spettroscopica e neuroinfiammazione

Equazione di Larmor

Quando un tessuto (ad esempio il cervello) è inserito in un campo magnetico esterno (che indichiamo B), il momento angolare di spin dei nuclei degli atomi che lo compongono descrive un moto di precessione attorno alla direzione di B, con una frequenza angolare omega data dalla equazione di Larmor:

omega = gamma×B

dove gamma (detta rapporto giromagnetico) è una caratteristica del nucleo. Ad esempio, il nucleo di idrogeno ha un gamma di 267.513×106 rad s−1 T −1, il nucleo di carbonio ha un gamma di 67.262×106 rad s−1 T −1, etc.

Risonanza magnetica

Quando un nucleo inserito in un campo magnetico esterno B viene esposto a un radiazione elettromagnetica con frequenza pari alla sua frequenza angolare omega (indicata dalla equazione di Larmor), allora il nucleo produrrà a sua volta una emissione elettromagetica. Negli apparecchi di risonanza magnetica usati in ospedale, il segnale emesso dai nuclei di idrogeno presenti nei tessuti inseriti in un campo magnetico esterno, viene intercettato da antenne ed elaborato da un software che permette di localizzarne la posizione relativa, ricostruendo una immagine del tessuto.

Risonanza magnetica spettroscopica

Come detto, le emissioni elettromagnetiche dei nuclei di idrogeno dei tessuti sottoposti a un campo magnetico esterno fisso e a una emissione elettromagnetica avente una frequenza pari alla loro frequenza angolare omega, sono usate per produrre una immagine del tessuto stesso. Tuttavia è possibile utilizzarle anche per fornire una indicazione sulla concentrazione di alcune specie chimiche in esso contenute. Questo è fattibile grazie al fenomeno detto ‘spostamento chimico’ (chemical shift) il quale è legato alla interferenza che il contesto molecolare del nucleo atomico esercita sul campo magnetico in cui esso è inserito. Senza entrare nei dettagli, si consideri che a seconda della molecola a cui il nucleo di idrogeno appartiene, il campo magnetico esterno sarà alterato, e dunque risulterà alterata anche la frequenza angolare fornita dalla equazione di Larmor. A seconda del valore assunto da omega sarà allora possibile capire se gli atomi di idrogeno appartengono a molecole di colina, o di lattato etc. Su questo principio si basa la risonanza magnetica spettroscopica, che consente di fornire la concentrazione di varie specie chimiche in una regione (in genere un centimetro cubo) di tessuto, che sia un cervello o un muscolo scheletrico. In figura 2 abbiamo ad esempio la concentrazione di diverse specie chimiche in un centimetro cubo di materia bianca del cervello di un essere umano (Bertholdo, D et al.), (Safriel Y et al. 2005).

spettro
Figura 2. Risonanza magnetica spettroscopica di un cervello umano, con indicazione della concentrazione di colina (Cho), creatina (Cr) e lattato (Lac). Echo time (TE) di 135 ms.

Risonanza magnetica spettroscopica e malattie

La risonanza magnetica spettroscopica del cervello può essere utilizzata per la diagnosi di malattie metaboliche, attraverso la misura del lattato. Nella ME/CFS ad esempio è stato possibile dimostrare un incremento significativo del lattato nei ventricoli laterali dei cervelli dei pazienti (Mathew, 2009). Altre applicazioni possibli sono quelle oncologiche, infatti lesioni neoplastiche del cervello sono associate a un aumento di colina (Cho) e a una riduzione di N-acetilaspartato (NAA). In questi casi la risonanza magnetica spettroscopica permette sia una diagnosi precoce, che il monitoraggio della risposta alle terapie (Bertholdo, D et al.).

Risonanza magnetica spettroscopica nella ME/CFS e nella Lyme

Di particolare interesse  per malattie come la ME/CFS e la malattia di Lyme potrebbe essere la correlazione tra un aumento di colina (o meglio, del suo rapporto con la creatina, Cho/Cr) e fenomeni infiammatori. Nella ME/CFS un livello elevato del rapporto Cho/Cr è stati riscontrato sia nella corteccia occipitale (Puri BK et al. 2002) che nei gangli della base (Chaudhuri BR et al. 2003), (Tomoda A et al. 2000). In questi studi non si apprezzavano alterazioni anatomiche concomitanti. Nella neuroboreliosi, uno studio del 2004 su 12 pazienti ha rilevato un incremento significativo del rapporto Cho/Cr nella materia bianca dei lobi frontali, in assenza di lesioni apprezzabili del parenchima (Ustymowicz A et al. 2004). Alterazioni simili sono state descritte nella neurite ottica (Tourbah A et al. 1999) e nella infezione da virus dell’epatite C (Forton DM et al. 2001). Forton e colleghi ipotizzarono che l’origine di queste alterazioni fosse da ricondurre a uno stato di attivazione della microglia. Un aumento del rapporto Cho/Cr in pazienti con HIV è stato attribuito a un aumento di attività delle cellule gliali (astrociti, oligodendrociti, cellule di Schwann e microglia) (Chang L et al. 1999) ed è ritenuto riflettere la presenza di fenomeni infiammatori (Lee PL et al. 2003). Un aumento del rapporto Cho/Cr è stato riscontrato anche in lesioni infiammatorie nella toxoplasmosi cerebrale (Roberto J et al. 2009).

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Figura 3. Volume di 64 cm cubici nel la materia bianca sopraventricolare di un maschio con clinica ME/CFS e infezione attiva da Borrelia burdorferi. TE: 135 ms, campo magnetico di 3 T. Si nota una regione dell’emisfero destro con aumento di Cho/Cr, probabilmente riconducibile a una lesione infiammatoria.

Il caso di un paziente

In figura 3 abbiamo il caso di un uomo con clinica compatibile con ME/CFS e infezione attiva da Borrelia burgdorferi (PCR positiva su sangue periferico). L’immagine è stata ottenuta con un campo magnetico di 3 tesla e un echo time di 135 ms. Si può notare nell’emisferso destro (a sinistra dell’osservatore) una regione della materia bianca sopraventricolare in cui il valore del rapporto Cho/Cr cresce rispetto al tessuto circostante e rispetto alla medesima regione dell’emisfero sinistro. Il valore risulta elevato anche rispetto al valore medio del Cho/Cr di controlli sani per la stessa sede anatomica (centrum semiovale), che è di 1.05, con una deviazone standard di 0.13 (Lee PL et al. 2003).  In assenza di lesioni macroscopiche visibili e di qualunque sospetto di neoplasia, questa alterazione potrebbe essere riconducibile a un processo infiammatorio legato a una infezione cerebrale da Borrelia burgdorferi, il cui DNA è stato rilevato nel sangue del paziente pochi mesi dopo questo esame. Si osserva che il paziente riferiva episodi di irrigidimento dell’emisoma controlaterale (il sinistro). Il suo sistema immunitario innato è risultato profondamente alterato con livelli di IL-1beta, IL-8, IL-6, MCP1, MIP-1beta che sono da decine a centinaia di volte oltre il massimo del valore normale. Il suo sistema immunitario adattivo produce anticorpi contro il sistema nervoso centrale.

La conta delle NK CD57+ nelle malattie autoimmuni, nella ME/CFS e nella malattia di Lyme

La conta delle NK CD57+ nelle malattie autoimmuni, nella ME/CFS e nella malattia di Lyme

Introduzione

Alcuni laboratori offrono la conta delle cellule natural killer che esprimono il CD57 (NK CD57+ o anche CD3-CD57+) come test di supporto alla diagnosi della malattia di Lyme e, soprattutto, come marcatore utile a monitorare la risposta del paziente alla terapia antibiotica. Valori bassi della conta assoluta di questa sottopopolazione linfocitaria sarebbero indicativi di una infezione in corso da B. burgdorferi sl. Vediamo brevemente quali sono i dati a favore e quelli a sfavore dell’uso di questo esame immunitario nella malattia di Lyme.

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Figura 1. Rappresentazione qualitativa delle sottoclassi delle cellule NK, identificate dagli antigeni CD56, CD57 e CD16. Si noti che la sottopopolazione che esprime il CD57 è costituita prevalentemente da NK che esprimono contemporaneamente il CD56DIM e il CD16. Disegno di Paolo Maccallini.

Cosa si intende per CD57?

Il CD57 è una glicoproteina rinvenuta per la prima volta nel 1981 sulla superficie delle cellule natural killer (NK) (Abo, T et Balch CM, 1981), un tipo di globuli bianchi coinvolti principalmente nella difesa contro infezioni intracellulari. Il CD57 è presente solo in una sottopopolazione di NK (Figura 1), ma è espresso anche da alcune cellule T CD4+ (Velardi A et al. 1986) e T CD8+ (Clement LT et al. 1984) (Figura 2), nonché da varie cellule del sistema nervoso centrale e periferico dei vertebrati (Schuller-Petrovic S et al. 1983).

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Figura 2. Sottopopolazioni linfocitarie che esprimono il CD57. Si noti che le NK CD57+ possono anche essere designate CD3-CD57+, in quanto non esprimono l’antigene CD3, a differenza delle cellule T CD57+, che invece possono essere designate CD3+CD57+. Disegno di Paolo Maccallini.

NK CD57+ e malattia di Lyme

Nella malattia di Lyme è stato riportata una riduzione della conta delle NK CD57+ (ma non delle cellule T CD8+CD57+ né delle NK CD56) in uno studio su 73 pazienti con sintomi persistenti della malattia di Lyme (Stricker RB et Winger EE 2001) e in almeno due case study (Stricker RB et al. 2002), (Stricker RB et Winger EE 2003). Questi dati tuttavia non sono stati confermati in uno studio successivo su nove pazienti Lyme con sintomi cronici (Marques A et al. 2009). Stricker e colleghi osservarono che i valori più bassi della conta delle NK CD57+ competeva a pazienti Lyme con sintomi cronici di tipo neurologico, e che un trattamento antibiotico in grado di portare i pazienti alla remissione, comportava anche la normalizzazione della conta delle NK CD57+ (vedi Figura 3). Da queste rilevazioni (per ora non confermate da altri autori) e dalla constatazione di valori normali delle NK CD57+ nella infezione acuta da B. burgdorferi sl, Stricker e colleghi hanno proposto la conta delle NK CD57+ come un marcatore specifico e sensibile della persistenza di una infezione cronica nella malattia di Lyme (Stricker RB et Winger EE 2001).

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Figura 3. Conta delle NK CD57+ in pazienti Lyme con sintomi cronici di tipo neurologico (LDN), in Lyme con sintomi cronici muscolo-scheletrici (LDM), in pazienti Lyme in remissione (LDR), in controlli adulti sani (HV), in bambini con disordini del spettro autistico (ADS) e in una popolazione pediatrica sana (PHV). I dati dei gruppi LDN, LDM e LDR sono tratti da (Stricker et Winger 2001), quelli del gruppo HV sono da (Marques A et al. 2009). Quelli dei gruppi ASD e PHV sono da (Siniscalco D et al. 2016). I dati sono riportati come media (mean) più/meno una deviazione standard (SD). Grafico di Paolo Maccallini.

Perché le NK CD57+ diminuiscono?

Una possibile giustificazione del motivo per il quale le NK CD57+ dovrebbero ridursi di numero nella infezione cronica da B. burgdorferi sl è stata proposta dallo stesso Stricker, il quale ha notato che questi leucociti sono inibiti dalle citochine sintetizzate dalle T CD4+, ovvero INF-γ, TNF-α e IL-2; dunque una loro riduzione potrebbe riflettere una stimolazione cronica delle T CD4+ da parte di B. burgdorferi sl (Stricker RB et al. 2002). Questa ipotesi è consistente con l’osservazione che nella malattia di Lyme si manifesta una attivazione selettiva delle cellule T CD4+ (Yssel H et al. 1991). De Meirleir ha proposto invece uno scenario in cui la prostrglandina E2 sopprime la risposta imunitaria delle NK, tra cui in particolare quella delle NK CD57+ (De Meirleir K et al. 2016, in IACFS/ME 2016 syllabus, pag 30).

NK CD57+ in altre patologie

Sebbene sia stato riportato dagli stessi autori che tale conta risulta normale in diverse patologie infettive e autoimmuni, è tuttavia da rilevare che recentemente un ridotto numero di NK CD57+ è stato riportato anche in bambini con manifestazioni dello spettro autistico (Siniscalco D et al. 2016) (vedi Figura 3). Inoltre una deplezione dei leucociti che esprimono il CD57 è stata in passato riferita in malattie autoimmuni come il lupus eritematoso sistemico e la sindrome di Sjögren (Struyf NG et al. 1990) (vedi figura 4). In base a quest’ultima osservazione, una misurazione contemporanea delle NK CD57+ e delle cellule T CD57+ sembrerebbe dunque necessaria a discriminare tra malattie autoimmuni e infezione cronica da B. burgdorferi sl. Recentemente De Meirleir ha proposto uno scenario in cui la prostraglandina E2 indotta da lipopolisaccaridi provenienti da batteri intestinali deprime le cellule NK, e in particolare riduce il numero delle NK CD57+, nei pazienti affetti da ME/CFS (De Meirleir K et al. 2016, in IACFS/ME 2016 syllabus, pag 30). Nella ME/CFS, due studi hanno dimostrato una riduzione del numero delle cellule Natural Killer che esprimono il CD57 (Gupta S et Vayuvegula B 1991), (Tirelli U et al. 1994).

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Figura 4. Conta delle CD45+ CD57+ nella syndrome di Sjögren (SS), nel lupus eritematoso sistemico (SLE) e nei controlli sani (HV). I dati sono presi da (Struyf NG et al. 1990) e sono stati convertiti da media + errore standard a media (mean) più/meno deviazione standard (SD), per renderli omogenei a quelli della figura 3, anche se qui non abbiamo una distribuzione gaussiana.
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Figura 5. Sottopopolazioni linfocitarie di una paziente con clinica CFS e PCR positiva per Borrelia burgdorferi. Le CD45+ sono complessivamente ridotte. I valori dele CD3-CD57+ sono stati ottenuti sottraendo il valore delle CD3- CD57+ a quello delle CD45+ CD57+. Tabella di Paolo Maccallini.

Discussione di un caso

Come abbiamo visto la riduzione del numero delle NK CD57+ non è un marcatore specifico della malattia di Lyme, infatti l’insieme dei linfociti che esprimono il CD57+ (ovvero i CD45+CD57+) risultano complessivamente depressi in almeno due patolgie autoimmuni (Lupus sistemico e Sjögren), mentre le NK CD57+ sono depresse nei disturbi dello spettro autistico (dove però non è stata effettuata una misura dei CD45+CD57+). Un modo per aumentare la specificità di questo marker sarebbe quello di misurare contemporaneamente le NK CD57+ e le T CD57+ (oppure le CD45+CD57+), infatti Stricker e colleghi dimostrarono che nella Lyme cronica le prime risultavano depresse, mentre le seconde non lo erano, e questa sembra una circostanza peculiare della Lyme (che andrebbe però confermata da studi indipendenti). In figura 5 riporto le sottopopolazioni linfocitarie di una paziente con clinica ME/CFS e PCR positiva per Borrelia burgdorferi. Come si vede le sue NK CD57+ sono molto basse (21,2 cellule/microlitro). Tuttavia si vede anche che tutti i suoi linfociti che esprimono il CD 57 sono depressi (105 cellule/microlitro), mentre le cellule T che esprimono il CD57 (le CD3+CD57+) sono nella norma. Quindi il presente caso  rientra sia nel profilo descritto da Stricker e colleghi nel 2001 (Stricker et Winger 2001), che in quello riscontrato nelle malattie autoimmuni (Struyf NG et al. 1990).

Conclusioni

La conta delle NK CD57+ non costituisce un marcatore specifico della malattia di Lyme, infatti tutti i linfociti che esprimono il CD57 sono depressi anche nelle malattie autoimmuni. Un modo per aumentare la specificità di questo marcatore è quello di misurare contemporaneamente anche il livello delle CD3+CD57+, poiché nella malattia di Lyme è stata riportato un decremento delle NK CD57+, ma non delle CD3+CD57+.

Dove sono le infezioni?

Dove sono le infezioni?

“E allora? Dove sono le spirochete? Non riuscite a trovarle!”

Sam T. Donta

Il campione

Uno studio canadese appena pubblicato su PLOSone ha indagato il plasma (la componente liquida del sangue) di 25 persone con diagnosi di ME/CFS (criteri canadesi), 13 individui con diagnosi di malattia di Lyme cronica effettuata secondo criteri non ufficiali (ADCLS, alternatively diagnosed chronic Lyme disease), 11 persone con Lupus, 25 controlli sani (Miller RR et al. 2016).

L’analisi

L’analisi effettuata da Miller e colleghi consiste nella lettura di tutto l’RNA presente nel plasma. Questo RNA sarà in buona parte di origine umana, quindi dei programmi sottraggono le sequenze di RNA umano e confrontano le sequenze che restano, con quelle di tutti i virus e i batteri attualmente conosciuti. Nel caso si trovi una sequenza di RNA che coincide con una sequenza di un organismo noto, si procede a una tradizionale PCR per l’amplificazione dell’RNA di quell’organismo. In questo studio ci si è premurati di fare queste analisi anche su campioni privi di plasma, per identificare eventuali contaminazioni dovute al processo di lavorazione dei campioni.

Risultati

Lo studio Miller ha dimostrato che non ci sono differenze nel carico virale e batterico del plasma dei quattro campioni esaminati, ovvero ME/CFS, Lyme cronica diagnosticata con criteri non ufficiali, Lupus, e controllo sano. Di fatto non sembra esistere un microbioma del plasma umano, cioè il plasma umano risulterebbe essere essenzialmente sterile, anche nei controlli sani. Per quanto riguarda ad esempio il genere Borrelia, l’unica lettura positiva viene da un controllo sano.

Dove sono le infezioni?

Miller osserva che l’assenza di RNA virale e/o batterico nel plasma dei pazienti ME/CFS e ADCLS non esclude che queste due condizioni abbiano una causa infettiva, infatti lo studio ha considerato solo l’RNA nel plasma, cioè nella componente liquida del sangue (Miller RR et al. 2016). E in effetti diversi studi hanno dimostrato che la ricerca di virus nel sangue periferico non è in grado di rilevare la presenza di enterovirus, parvovirus, e herpesvirus nei tessuti (cervello, intestino, cuore) (IOM, 2015, pag. 159). Inoltre l’RNA batterico è una misura della velocità del metabolismo dei batteri, più che del loro numero.  Si possono dunque fare due osservazioni seguenti:

  1. La ricerca di RNA privilegia quei batteri che hanno un metabolismo elevato, ad esempio batteri in fase mitotica. In effetti l’RNA si può considerare come un indice della velocità metabolica, più che della carica batterica.
  2. Il plasma è solo uno dei tessuti umani, e non necessariamente rispecchia la carica batterica o virale di altri tessuti, come il cervello ad esempio, o dei leucociti presenti nel sangue.

Vediamo ora come si colloca questo studio rispetto a precedenti studi sulle infezioni nella ME/CFS e nella Lyme.

Traslocare o non traslocare?

Nella ME/CFS è stata dimostrata una anomala traslocazione dei batteri intestinali in almeno tre studi.

  1. In un primo studio di circa 10 anni fa,  Maes e colleghi rilevarono un aumento di anticorpi IgA e IgM contro lipopolisaccaridi (LPS) di persone con ME/CFS. La presenza di questa risposta delle cellule B non è altrettanto frequente nella popolazione sana e dimostra che il sistema immunitario dei pazienti ME/CFS entra regolarmente in contatto con batteri intestinali, la qual cosa è una prova di una traslocazione eccessiva (Maes M et al. 2007).
  2. Nove anni dopo un gruppo della Cornell University cercò una conferma della traslocazione del microbiota nella ME/CFS misurando, fra le altre cose, il livello di LPS e di CD14 solubile (sCD14) nel siero dei pazienti. Gli LPS sono essenzialmente di origine enterica, e il sCD14 è una sostanza prodotta di macrofagi come risposta agli LPS. Ebbene, questo gruppo ha dimostrato un incremento significativo di questi due parametri nei pazienti rispetto ai controlli sani (vedi figura 7), e ciò prova una eccessiva traslocazione (Giloteaux L et al. 2016).
  3. Nel 2015 Shukla e colleghi dimostrarono (con una tecnica di amplificazione del gene per l’RNA ribosomiale 16S) che il sangue dei pazienti ME/CFS ospita più batteri della flora intestinale, rispetto al controllo sano, sia a riposo che, soprattutto, 48 ore dopo un esercizio (Shukla, SK et al. 2015).

Come si vede, in questi tre studi abbiamo prove indirette (primi due) e dirette (il terzo) della presenza di batteri intestinali nel sangue dei pazienti ME/CFS, in misura maggiore rispetto ai controlli sani. Dunque, lo studio Miller sembra in contraddizione con i citati tre studi.

E l’HHV6?

Nel 2003 Nicolson riuscì ad amplificare il materiale genetico dell’HHV-6 nel plasma di 61/200 (30%) pazienti ME/CFS rispetto a soli 9/100 (9%) controlli sani (p<0.01) (Nicolson GL et al 2003). Peterson riportò la presenza del ceppo A di questo stesso virus nel 29% dei campioni di siero (una parte del plasma) e nel 20% dei campioni di liquido spinale dei pazienti ME/CFS. Non mi pare questo studio sia stato pubblicato, ma i dati sono riportati in questo PDF, e sono stati citati in vari contesti. Anche qui ci sono delle incongruenze con lo studio Miller.

EBV e replicazione abortiva

Diversi studi avrebbero dimostrato che nella ME/CFS i virus erpetici hanno una replicazione parziale (‘abortiva’) che consiste nella immissione nel circolo sanguigno di alcune proteine virali, non dell’intero virus (IOM, 2015, pag. 160). In particolare, Lerner AM e colleghi proposero un modello di replicazione abortiva dell’EBV, in cui le cellule infette rilasciano nel sangue solo alcune proteine del virus (dUTPasi e DNA polimerasi) senza replicazione completa del virus stesso (Lerner AM, 2012), che dunque non può essere trovato nel sangue con metodi di ricerca come quello effettuato da Miller.

Borrelia

Come abbiamo visto, l’analisi di Miller ha identificato il genere Borrelia (che comprende anche specie non chiaramente patogene) nel plasma di un solo soggetto, appartenente al controllo sano. Si può osservare che lo studio non comprendeva nessun gruppo con diagnosi canonica di malattia di Lyme, ma solo un gruppo di 13 pazienti con diagnosi ‘alternativa’ di malattia di Lyme, cioè basata sul quadro clinico e su test non approvati. Ciò detto, è ben noto che persino nella fase acuta della borreliosi, la sensibilità della ricerca del DNA (non dell’RNA) nel sangue dei pazienti è del 10% (Mygland A et al. 2010). Nel caso poi di pazienti con malattie di lunga durata, che abbiano superato da mesi o anni la fase acuta, si ipotizza che il battere B. burgdorferi abbia un tasso replicativo basso o bassissimo (Feng J et al 2014), (Embers, 2012), (Sharma, 2015). Questo rende improbabile l’evenienza di recuperare DNA nel sangue periferico di pazienti cronici, e ancora meno probabile la possibilità di recuperare RNA, che è proporzionale alla velocità del metabolismo batterico.

Conclusione

Probabilmente lo studio Miller permette di escludere la presenza di una infezione acuta nella ME/CFS, che dovrebbe poter essere rilevata nel plasma. Ma nulla dice su infezioni meno attive, o che interessino altri tessuti (cervello, cuore, o le stesse cellule del sangue). Inoltre sembra contraddire l’ipotesi della traslocazione del microbiota intestinale nella ME/CFS, ipotesi sin qui avvalorata da almeno tre studi (Maes M et al. 2007), (Shukla, SK et al. 2015), (Giloteaux L et al. 2016).

Approfondimenti

  • La traslocazione dei batteri intestinali nella ME/CFS, insieme ad altre considerazioni sul microbiota intestinale, è discussa in questo post.
  • Il ruolo della persistenza della infezione da B. burgdorferi nei sintomi cronici della malattia di Lyme è discusso qui.

 

Un nuovo test per la malattia di Lyme

Un nuovo test per la malattia di Lyme

Introduzione

Nel 2015, uno studio della George Mason University (VA, USA) ha valutato la sensibilità e la specificità -nella malattia di Lyme- di un test che impiega delle particelle appositamente create per intrappolare le eventuali proteine OspA presenti nelle urine dei pazienti. I ricercatori hanno riportato una sensibilità e una specificità del 100% nella Lyme precoce localizzata (EM) e dei dati interessanti anche per la post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS), riesumando l’interesse per la ricerca diretta di antigeni specifici di B. burgdorferi sl nei fluidi biologici dei pazienti (1).

Cenni storici

Negli anni sono stati effettuati alcuni tentativi di rilevamento della proteina di superficie A (OspA) nel liquido cerebrospinale di pazienti con neuroborreliosi. In uno di questi, in particolare, si effettuò la misura dell’OspA nel liquor di 83 individui con vari sintomi neurologici, provenienti da un’area endemica per malattia di Lyme. La misura venne effettuata ‘catturando’ l’OspA per mezzo di un anticorpo antigene-specifico, attraverso il metodo descritto in Figura 1. Si rilevò la presenza della proteina nel 42% dei campioni, dei quali però solo il 57% era sieropositivo per B. burgdorferi sl (2). In un esperimento del 1989, un metodo analogo fu utilizzato per rilevare la presenza di OspA nell’urina di persone con una ben documentata malattia di Lyme. Su dieci pazienti analizzati, tutti sono risultati positivi all’esame, mentre nessuno dei dieci controlli sani dimostrò la presenza di OspA nelle urine (3). Nel complesso, l’affidabilità di questo genere di test è stata tuttavia ritenuta bassa (4).

Il nuovo test

Un test per la ricerca di OspA nelle urine dei pazienti Lyme deve superare tre difficoltà:

  1. la bassa concentrazione di questo antigene nelle urine;
  2. la possibile non specificità dell’anticorpo utilizzato per rilevare l’OspA nei campioni;
  3. la possibile inadeguata sensibilità dell’anticorpo per le OspA delle varie specie patogene di borrelia.

Il gruppo della George Mason University ha risolto il primo ostacolo progettando una particella di diametro nanometrico in gradi di sequestrare le eventuali molecole di OspA presenti nel campione di urine. In questo modo, all’interno della nano-particella si raggiungono concentrazioni elevate dell’antigene. Le altre due difficoltà hanno richiesto un esame approfondito del database di proteine attualmente conosciute, il quale ha portato a identificare la regione che va dall’amminoacido 219 al 253 di OspA, come una regione non omologa a nessun altra proteina di origine umana o di altri agenti infettivi. L’anticorpo utilizzato si lega a questo peptide, quindi riconosce solo l’OspA. Inoltre questo legame richiede la sequenza 236-239 di OspA, la quale è comune alle principali specie patogene di borrelia (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi ss, B. valaisian, B. spielmani, B. bissetti). Tutto questo dovrebbe garantire la specificità e la sensibilità del test.

Risultati

Ebbene, su 24 pazienti con eritema migrante, 24 sono risultati positivi al test; inoltre dei 117 controlli sani nessuno è risultato positivo. Questo depone per una specificità del 100% e per una sensibilità del 100% nella Lyme precoce localizzata. La presenza dell’OspA nelle urine scompare negli individui in cui il trattamento ha avuto successo, evidenziando anche la potenzialità del test di monitorare l’andamento della terapia. Gli autori si sono preoccupati infine di sottoporre all’esame 100 pazienti affetti da PTLDS, riscontrando l’antigene nel 41% dei pazienti, il che proverebbe una infezione attiva in questi soggetti (1).

E i falsi positivi?

Detto questo, è possibile muovere una critica dal punto di vista teorico per quanto riguarda la progettazione del test. Infatti gli Autori hanno identificato l’epitopo specifico dell’OspA solo sulla base delle sequenze di amminoacidi. Questo tipo di analisi non permette di sapere se esistono epitopi conformazionali simili su altre proteine. Pertanto possono esservi regioni di altre proteine rese simili alla sequenza 219-253 di OspA dal ripiegamento della catena peptidica (5). Questi antigeni saranno riconosciuti erroneamente come OspA dal test. Quindi si ha un rischio teorico di falsi positivi che richiede ulteriori approfondimenti.

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Figura 1. Illustrazione del procedimento usato nei vecchi test per la ricerca diretta di antigeni nei liquidi biologici. Una piastra opportunamente preparata cattura le proteine contenute nel campione (urine o liquor). Quindi un anticorpo specifico per OspA viene aggiunto. In seguito un ulteriore anticorpo (detto secondario) specifico per la regione Fc delle IgG e coniugato a un enzima (in genere l’Horseradish peroxidase) viene inserito. Se l’OspaA è stato catturato sulla piastra, allora l’AC secondario si legherà all’anti-OspA. Un substrato viene quindi aggiunto, il quale emette una specifica radiazione luminosa se entra in contatto con l’enzima dell’anticorpo secondario. Disegno di Paolo Maccallini.

Conclusioni e prospettive

Attualmente i CDC non raccomandano questo test (6), è questo è più che ragionevole, visto che la sua validità è stata dimostrata in un solo studio. È tuttavia previsto il suo impiego nell’ambito di una ricerca sulla ME/CFS presso la Stanford University, affianco ai normali test sierologici per B. burgdorferi sl. Questo e altri studi consentiranno auspicabilmente di accertare se la procedura possa essere considerata o meno affidabile nella diagnostica della malattia di Lyme. L’ingegnere Alessandra Luchini, inventrice delle ‘nanotrappole’, ha raccontato in un incontro presso la George Mason University (7) (vedi sopra) il percorso di vita e di ricerca che ha portato alla messa a punto di questa metodologia e alla sua applicazione in altri ambiti, come quello oncologico.

Riferimenti

  1. Magni, R, et al. Application of Nanotrap technology for high sensitivity measurement of urinary outer surface protein A carboxyl-terminus domain in early stage Lyme borreliosis. Journal of translational medicine. November 2015, Vol. 13, 346.
  2. Coyle, PK, et al. Detection of Borrelia burgdorferi-specific antigen in antibody-negative cerebrospinal fluid in neurologic Lyme disease. Neurology. 1995, Vol. 45, 11.
  3. Hyde, F W, et al. Detection of antigens in urine of mice and humans infected with Borrelia burgdorferi, etiologic agent of Lyme disease. J Clin Microbiol. 1989, Vol. 27, 1.
  4. Aguero-Rosenfeld, ME, et al. Diagnosis of Lyme Borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. July 2005, Vol. 18, 3, p. 484–509.
  5. Morris, GE. Encyclopedia of life sciences. http://www.els.net. [Online] September 2007. [Riportato: 1 Aug 2016.] http://www.els.net/WileyCDA/ElsArticle/refId-a0002624.html.
  6. Centers for disease control and prevention. Laboratory tests that are not recommended. http://www.cdc.gov. [Online] Nov 2015. [Riportato: ]
  7. Luchini, A. Vision Series: Alessandra Luchini – “Nanotechnology in Biomedicine”. GMU-TV . [Online] April 2014.

Espressione genica nella malattia di Lyme: Lupus o ME/CFS?

Espressione genica nella malattia di Lyme: Lupus o ME/CFS?

RNA messaggero, monociti, e malattia di Lyme

All’inizio di questo anno è apparso sulla testata American Society for Microbiology  una indagine sulla espressione genica in 29 soggetti con malattia di Lyme, rispetto a un controllo di 13 persone sane. L’analisi è consistita nella misura degli RNA messaggeri in cellule mononucleri del sangue periferico (PBMC). L’RNA messaggero (mRNA) è la forma del codice genetico che le nostre cellule usano per copiare e spedire l’informazione del gene da esprimere, ai ribosomi, ovvero alle macchine che materialmente assemblano le proteine. Le PBMC sono le cellule del sangue periferico provviste di un singolo nucleo, e consistono in cellule B, cellule T, cellule NK, e monociti. Dunque essenzialemnte linfociti, macrofagi, e cellule dendritiche (vedi figura 1). Gli Autori sono stati così in grado di individuare un totale di 1759 geni espressi in modo differente dai pazienti (sovra espressi o sotto espressi), rispetto ai controlli sani e di monitorare l’evoluzione della malattia prima del trattamento, subito dopo il trattamento, e sei mesi dopo il trattamento.

leukociti
Figura 1. Ho rappresentato in modo schematico l’insieme dei leucociti, evidenziando la loro origine e anche la loro appartenenza ai due rami del sistema imunitario. Le PBMC a cui mi riferisco nel testo sono date dall’insieme dei linfociti e dei monociti. Disegno di Paolo Maccallini. Da varie fonti, con modifiche.

Lo studio ha visto la collaborazione della University of California con la John Hopkins University School of Medicine e la San Francisco State University.

Il sistema immunitario non guarisce dopo il trattamento

Uno dei risultati più interessanti di questo studio è l’osservazione che il trattamento antibiotico, pur tempestivo, non consente ai pazienti di tornare alla normalità. Infatti a sei mesi dalla fine del trattamento (3 settimane di doxiciclina) ben 686 geni rimangono espressi in modo anomalo rispetto al controllo sano (vedi figura 2). Non solo, ma questa anomalia permane a prescindere dalla risoluzione o meno dei sintomi. Infatti tanto coloro che manifestano sintomi persistenti (metà dei casi!), che coloro i quali guariscono a seguito della cura, permangono in una condizione di complessiva attivazione immunitaria. E sorprendentemente l’analisi di queste centinaia di geni non consente di differenziare le persone con sintomi residui, da quelle con risoluzione del quadro clinico. Forse la spiegazione dei sintomi residui non è nelle PBMC?

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Figura 2. Il numero dei geni espressi in maniera diversa fra Lyme e controllo sano (DEG). Si tratta di complessivi 1759 geni. V1 indica il momento della diagnosi (Lyme acuta), V2 indica il momento successivo al completamento della cura, V5 rappresenta i pazienti a sei mesi dalla fine del trattamento (Bouquet J, et al. 2016).

E i sieronegativi?

In questo studio sono stati inclusi anche pazienti con diagnosi esclusivamente clinica. Infatti si tratta di uno studio su Lyme acuta, e come sappiamo, circa metà dei soggetti con Lyme acuta non ha ancora avuto modo di sviluppare una risposta immunitaria adattiva al momento della diagnosi. In particolare, su 28 soggetti testati con l’algoritmo a due passi (vedi figura 3), solo 14 erano positivi prima del trattamento. Dei restanti 14, solo 6 hanno sviluppato gli anticorpi alla fine del periodo di osservazione. Rimangono dunque 8 soggetti sieronegativi (il 28,6%).

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Figura 3. Algoritmo per gli esami sierologici della malattia di Lyme. Da Wilske, B, Zoller, L e Brade, V. Lyme Borreliose, 2000. Con modifiche. Disegno di Paolo Maccallini.

La sieronegatività è un fenomeno noto nella Lyme (Perrone C, 2014), meno noto è tuttavia il motivo per il quale la risposta sierologica possa essere parziale o assente in alcuni individui. Una revisione della letteratura su questo argomento prescinde lo scopo del presente articolo, e mi limito a riportare quanto riscontrato invece nello studio di Bouquet e colleghi, i quali hanno potuto, per la prima volta, rilevare una anomala espressione di 4 geni nei sieronegativi, rispetto ai pazienti sieropositivi. In particolare, sono sovra espressi 3 geni del complesso HLA-D (cromosoma 6), i quali codificano per la molecola MHC-II. Questa molecola (costituita da due subunità) è espressa in particolare dai monociti e permette a queste cellule di presentare gli antigeni alle cellule Th, innescando così la risposta adattiva del sistema immunitario (vedi figura 4).

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Figura 4. Molecola MHC II e presentazione degli antigeni alle celleule Th. Disegno di Paolo Maccallini, da varie fonti, con modifiche.

La sovra espressione di questi geni (che sono HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB5, vedi figura 5) rimane più o meno costante durante i mesi della osservazione, e distingue chiaramente i sieronegativi dai sieropositivi, i quali curiosamente sotto esprimono gli stessi geni. Difficile immaginare una giustificazione per il fenomeno osservato, ma si potrebbe pensare che il sustema immunitario stia cercando di rimediare alla mancata attivazione del ramo adattivo, amplificando la presentazione degli antigeni. Questo è molto interessante, perché potrebbe essere una disfunzione alla base dei fenomeni autoimuni descritti nella malattia di Lyme.

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Figura 5. Tre geni della molecola MHC II sono sovra espressi nella Lyme sieronegativa.

Lupus o ME/CFS?

Una delle osservazioni più interessanti di questo studio è forse quella che deriva dalla comparazione della espressione genica della Lyme, a sei mesi dal trattamento, con altre patologie per le quali sono stati raccolti dati simili. Sorprendentemente gli autori hanno potuto constare che l’espressione genica dopo la fase acuta della infezione non assomiglia alla ME/CFS (con cui condivide solo il 18% degli DEG), ma è pittosto simile al Lupus, con cui condivide ben il 60% dei geni espressi in modo anomalo. Questo risultato non è banale, ed è in qualche modo inaspettato. Infatti in più contesti si è riscontrata la somiglianza tra la post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS) e la ME/CFS (Institute of Medicine, 2015), e la definizione di caso per la PTLDS non è molto diversa dai criteri Fukuda relativi alla CFS (Aucott JN et al. 2013). Tuttavia già in passato erano emerse differenze fra ME/CFS e PTLDS in due grandi studi (Shutzer, 2011), (Ajamian, 2015). Sicuramente ulteriori approfondimenti sono necessari, con un campione molto più esteso.

Un nuovo test?

Riuscire a descrivere un profilo di attivazione immunitaria specifico per la malattia di Lyme è di enorme interesse, infatti aprirebbe le porte a una nuova categoria di test diagnostici, non più basati sulla sierologia. Un siffatto strumento sarebbe di grande beneficio, soprattutto per i pazienti sieronegativi, che in questo studio rappresentano un non trascurabile 28,6%.

Conclusioni

Gli elementi di interesse di questo studio sono molteplici e vengono riassunti brevemente in quanto segue.

  • La malattia di Lyme attiva in modo anomalo ben 1759 geni nel citoplasma delle cellule mononucleri del sangue periferico (linfociti e monociti). Questa attivazione persiste 6 mesi dopo il trattamento, a prescindere dal successo o meno della cura, e differenzia i pazienti non solo dai controlli sani, ma anche da altre infezioni e patologie simili.
  • I pazienti sieronegativi presentano delle anomalie nella presentazione degli antigeni, di significato tutto da determinare.
  • Il profilo di attivazione genica configura la possibilità di un nuovo test per la malattia di Lyme.
  • La post-treatment Lyme disese syndrome è più simile al Lupus che alla ME/CFS.

Approfondimenti

  • Lo studio discusso in questo post è accessibile gratuitamente qui.
  • Una introduzione alla Post-treatment Lyme disease syndrome (PTLDS) è proposta in questo precedente post.
  • Una analisi su analogie e differenze fra ME/CFS e PTLDS è disponibile qui.

Testing the lymphocyte transformation test for Lyme disease

Testing the lymphocyte transformation test for Lyme disease

In questo articolo dimostro che un test LTT per malattia di Lyme che utilizzi come uno degli antigeni la OspC (proteina integra) di B. burgdorferi sensu stricto può teoricamente risultare positivo (falso positivo) in soggetti con aumentata permeabilità intestinale.

Abstract

Some lymphocyte transformation tests (LTT) popular in Europe for the diagnosis of Lyme disease, use full length OspC of B. burgdorferi as one of their antigens and request a positive stimulation index against only one or two antigens, in order to be considered positive. In what follows, we demonstrate that, in case of patients with gut bacteria translocation, such a test has a theoretical risk of false positive results.

Lymphocyte transformation test

Lymphocyte transformation test (LTT) is an assay which allows to measure the activity of peripheral blood Th cells against specific antigens. T cell activation starts shortly after infection, with T cells proliferation and the production of cytokines (such as INF-γ) which regulate the adaptive immune response (Sompayrac, 2012). As T cell response vanishes after the resolution of the infection (Kaech, et al., 2007), LTT may be useful in providing a proof of active infection. When a LTT assay is performed, Th cells from peripheral blood of a patient are exposed to proteins from a particular pathogen. If a significant reaction is noted, which could be either Th cells proliferation or INF-γ expression, the assay is considered positive and suggestive of an active infection by that particular pathogen. The response is expressed through a number, often referred to as stimulatory index (SI). In Lyme disease, several attempts have been made in order to obtain such a tool, either by T cells proliferation assays or by INF-γ measures (Dressler, et al., 1991), (Chen, et al., 1999), (Valentine-Thon, et al., 2007), (von Baehr, et al., 2012), (Callister, et al., 2016 May). Nevertheless, this procedure has not been fully recognized as useful at present and neither the European guidelines (Stanek, et al., 2011) nor the CDC (Centers for disease control and prevention, 2015) recommend the use of this kind of test.

TCR.png
Figure 1. Presentation of an antigen to a helper T cell by MHC II molecule.

Th cells activation and cross-reactive T cell epitopes

Th cells are activated when their T cell receptors (TCR) recognize a complementary antigen presented by MHC II molecules (see Figure 1) (Sompayrac, 2012). Peptides presented by MHC II to T helper cells are exclusively linear epitopes, and they have a length between 13 and 17 amino acids (Rudensky, et al., 1991). Various experiments have demonstrated that peptides with 5 identical amino acids in a sequence of 10 have good chances to represent cross-reactive T cell epitopes (Root-Bernstein, 2014). That said, the algorithm described above for the LTT test is not free from the risk of false positive results, as on the surface of an antigen there might be one or more linear epitopes of 10 amino acids which share at least 5 amino acids with some epitope of 10 amino acids from another pathogen. This risk is particularly high when the assay uses complete proteins as antigens, and when a high SI for only a few antigens is required in order to have a positive result of the test.

OspC and Pseudomonas aeruginosa

We have used BLAST from NCBI (National Library of Medicine), with OspC from Borrelia burgdorferi (strain ATCC 35210 / B31 / CIP 102532 / DSM 4680) identified by the swiss-prot ID Q07337 () as query sequence, settings being as follows: expected threshold of 10, BLOSUM62 as substitution matrix, and a word of 3 amino acids. We have built a custom database with the main Phyla of the human gut microbiome observed in a healthy population, which are Bacteroides, Firmicutes, Proteobacteria, Verrucomicrobia, Actinobacteria, Tenericutes, and Euryarchaeota (Giloteaux, et al., 2016). One of the possible matches that BLAST gives back is the following alignment between the query sequence and the outer membrane protein G (OprG) of Pseudomonas aeruginosa (PDB ID: 2X27):

OspC_OmpG.png

As you can see, we have 6 identical amino acids in a peptide 10 amino acids long. This means that this peptide from Borrelia burgdorferi could theoretically binds a Th cell previously activated by P. aeruginosa. As peptides presented by antigen presenting cells through MHC II are digested in the cytoplasm of these leukocytes, they do not need to be surface exposed in order to elicit a response in  Th cells, and don’t need to belong to a surface protein, either. But in an LTT assay, T cells are simply exposed to antigens, this means that the peptide 111-120 of OspC has to be surface exposed, otherwise it will not engage the T cell receptor. As you can see from Figure 2 this is actually the case. The 3D structure of OspC from B. burgdorferi strain B31 used for that picture has been experimentally determined with X rays and a resolution of 2,51 Å in 2001 (Kumaran, et al., 2001) and its MMDB ID is 15958 (). The conclusion from this data is that Th cells from a patient with an active infection by P. aeruginosa could proliferate and produce INF-γ when exposed to OspC from B. burgdorferi. In other words, a patient with an active P. aeruginosa infection would come out to have a positive LTT test for OspC.

OspC.png
Figure 2. Peptide 111-120 (in yellow) of OspC from B. burgdorferi (B31) is surface exposed.

Gut bacteria translocation

A disrupted mucosal barrier of the bowel, with consequent translocation of bacteria from the gut to the peripheral blood, has been described in patients with liver diseases (Zhu, et al., 2013), chronic HIV infection (Openshaw, 2009), Crohn’s disease (Wyatt, et al., 1993), and in myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome (ME/CFS) (Giloteaux, et al., 2016). In ME/CFS it has been possible, in particular, to demonstrate the translocation of Pseudomonas aeruginosa, among other gram-negative enterobacteria. In fact serum concentration of IgA against lipopolysaccharides from P. aeruginosa and other enterobacteria has been found to be significantly greater in ME/CFS patients than in normal volunteers (Maes, et al., 2007). Thus in ME/CFS patients the adaptive immune system usually reacts against pathogens which exit from the gut, and in particular we know that it reacts against P. auruginosa.

Lyme disease LTT test and ME/CFS

We will now discuss the theoretical risk of false positive results, in the ME/CFS population, of a specific LTT test for Lyme disease, widely used in Europe. This test provides results for the reaction of Th cells against three sets of antigens:

  1. Borrelia burgdorferi ‘Fully Antigen’, which are antigens from burgdorferi B31;
  2. Borrelia burgdorferi ‘OSP-mix’, which are OspA, OspC, and DbpA from the three main European pathogenic species of Borrelia (B. burgdorferi, B. garinii and B. afzelii);
  3. Borrelia burgdorferi LFA-1, which is a linear epitope shared by OspA (B. burgdorferi ss) and by some human leukocytes.

As you can see, OspC from B.burgdorferi sensu stricto is present in both the first and the second set of antigens. Based on what discussed above, we are now able to predict that Th cells from the peripheral blood of a patient with P. aeruginosa translocation due to gut increased permeability, might react in both these assays, thus leading to a false positive LTT test for Lyme disease.

Conclusion

ME/CFS patients are among the main users of this kind of tests, because of the similarities between Lyme disease and the clinical picture of ME/CFS (Gaudino, et al., 1997). ME/CFS patients have a high prevalence of increased gut permeability and gut microbiome translocation (Giloteaux, et al., 2016), and their immune system reacts against P. aeruginosa in many cases (Maes, et al., 2007). Thus, each LTT test for Lyme disease which uses full length OspC from B. burgdorferi ss as antigen, could theoretically lead to a high rate of false positive results in this population of patients. The Lyme disease LTT test discussed above, which is currently popular in Europe, is one of such tests. More researches are warranted in order to confirm or exclude the theoretical danger of cross reaction of Lyme disease LTT tests with gut microbiome. Moreover, on the basis of what here presented, it might be possible to develop an LTT test specific for the diagnosis of gut bacteria translocation.