Mitocondri norvegesi, primo atto: amminoacidi

Mitocondri norvegesi, primo atto: amminoacidi

L’antefatto

A fine ottobre, durante l’ultima IACFS/ME (una conferenza biennale che riunisce i maggiori esponenti della ricerca sulla ME/CFS) i due oncologi Öystein Fluge e Olav Mella dell’ospedale universitario di Bergen (Norvegia), avevano presentato dei risultati preliminari che sembravano evidenziare un difetto nel metabolismo energetico dei pazienti ME/CFS. Ma la parte più interessante del loro intervento consisteva nell’avere proposto una possibile origine di questo difetto, nell’avere cioè potuto localizzare la vera fonte dei problemi. Circa un mese dopo – a Stoccolma – Öystein Fluge aveva di nuovo stuzzicato la curiosità di pazienti e ricercatori, durante una seconda conferenza scientifica, senza però fornire dati precisi. Esiste un video di questo secondo intervento (qui). Fluge e Mella sono famosi nella comunità ME/CFS, e lo sono per un motivo sensato: hanno trovato un potenziale trattamento per più del 50% dei pazienti. Si tratta di un anticorpo monoclonale (Rituximab) che uccide la sottopopolazione di cellule B che esprime l’antigene CD20 sulla superficie. L’effetto della terapia è spesso temporaneo, ma in qualche caso la remissione è permanente (Fluge Ö et al. 2015). Sono due scienziati rispettati, e in Norvegia hanno ottenuto il sostegno del governo nella loro ricerca sulla ME/CFS. In definitiva, da ottobre è iniziata l’attesa per la pubblicazione che avrebbe svelato un possibile nodo centrale del difetto metabolico nella ME/CFS. Tuttavia i bene informati avevano già cominciato a bisbigliare un nome, a masticarlo nelle loro riflessioni; a evocarlo forse anche durante la loro vita onirica: piruvato deidrogenasi.

La pubblicazione, tre studi in uno

Lo studio è stato pubblicato il 22 dicembre sulla rivista JCI insight e si trova qui. Lo studio consiste in tre parti:

  1. una analisi di alcuni metaboliti rilevanti per il metabolismo energetico;
  2. uno studio di espressione genica di alcune proteine rilevanti nel metabolismo energetico;
  3. uno studio in vitro in cui cellule muscolari umane sono coltivate con siero dei pazienti.

In questo articolo illustrerò la prima parte dello studio, contestualizzando i risultati rispetto a due precedenti studi.

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Figura 1. Catabolismo degli amminoacidi. I percorsi metabolici lungo i quali gli amminoacidi alimentano il metabolismo energetico. Da (Fluge O et al. 2016), con modifiche.

Primo atto, amminoacidi e ciclo dell’acido citrico

Sono stati esaminati campioni biologici di 200 pazienti ME/CFS (162 donne e 38 maschi) e 102 controlli sani. La concentrazione dei 20 amminoacidi standard è stata misurata con l’uso di uno spettrometro di massa. Gli amminoacidi sono stati classificati in tre categorie, in funzione del loro punto di ingresso nei percorsi metabolici energetici (figura 1). Infatti in assenza di glucosio in persone sane, così come in particolari patologie metaboliche, gli amminoacidi possono essere ‘bruciati’ per produrre energia, in un processo detto catabolismo degli amminoacidi (Bryant Miles, 2004), (Salway JG 2004). I tre gruppi sono:

  1. Categoria I. Sono gli amminoacidi che vengono convertiti in piruvato: alanina (Ala), cisteina (Cys), glicina (Gly), serina (Ser), e treonina (Thr).
  2. Categoria II. Sono gli amminoacidi che vengono convertiti in acetil-coenzima A (acetil-CoA), e che dunque alimentano direttamente il ciclo dell’acido citrico (TCA): isoleucina (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), fenilalanina (Phe), triptofano (Trp), e tirosina (Tyr).
  3. Categoria III. Sono amminoacidi che vengono convertiti in metaboliti intermedi del ciclo del TCA: metionina (Met) e valina (Val), convertiti in succinil-CoA; istidina (His), glutamine (Gln), acido glutammico (Glu), e prolina (Pro), convertiti in alpha-chetoglutarato; asparagina (Asn) e aspartato (Asp), convertiti in fumarato o oxaloacetato.

Nello schema in figura 1 si indica Glx la somma Gln+Glu e Asx la somma Asn+Asp. Le stesse categorie e i metaboliti verso cui convergono sono riassunti nello schema in figura 2. Questo tipo di schematizzazione è semplificata, infatti gli amminoacidi sono coinvolti in numerosi altri percorsi metabolici. Per esempio il triptofano, in presenza di fenomeni infiammatori, può essere degradato in acido quinolonico e acido chinurenico (Mehraj, V et Routy JP 2015), piuttosto che essere catabolizzato in acetil-CoA. Ma le semplificazioni sono molto utili in un sistema così complesso, come il metabolismo. I risultati di questa analisi sono riportati in figura 2. Come si vede:

  • non ci sono differenze significative tra i pazienti e il controllo, negli amminoacidi della categoria I (quelli convertiti in piruvato), con eccezione della alanina;
  • gli amminoacidi della categoria II sono ridotti nelle donne, ma normali negli uomini, con la eccezione della tirosina, ridotta anche nei maschi;
  • gli amminoacidi della categoria III sono ridotti nelle donne, ma normali nei maschi.

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Figura 2. Le tre categorie di amminoacidi, classificati in base al metabolita del metabolismo energetico in cui si convertono. Tabella di Paolo Maccallini.

Le donne sono diverse

Come si vede, si ha una significativa riduzione degli amminoacidi della categoria II e III nelle donne con ME/CFS, ma non nei maschi. Poiché gli amminoacidi della categoria II convergono nella sintesi di acetil-CoA e quelli della categoria III sono utilizzati per alimentare il ciclo del TCA a vari livelli, gli autori hanno dedotto che il ciclo del TCA non è adeguatamente alimentato dalla glicolisi e – per compensare – utilizza gli amminoacidi delle categorie II e III. Se si osserva la figura 1, il lettore può ipotizzare da solo che vi sia un qualche difetto nell’enzima piruvato deidrogenasi (PDH), il quale trasforma il piruvato in acetil-CoA. E questa è proprio l’ipotesi proposta da Fluge, Mella e il loro gruppo:

  • nelle donne con ME/CFS un blocco dell’enzima PDH non permette alla glicolisi di rifornire di Acetil-CoA il ciclo del TCA, così vengono bruciati amminoacidi della categoria II e III come forma di compenso.

Atrofia muscolare

In cerca di spiegazioni per la mancanza di alterazioni nel profilo metabolico dei maschi, gli Autori hanno misurato il livello sierico della 3-metilistidina  (3-MHis), una molecola che si eleva quando – in mancanza di cibo – gli esseri umani cominciano a nutrirsi dei propri stessi tessuti, ovvero catabolizzano i propri muscoli, utilizzandoli come fonte di proteine. Nelle donne il livello di 3-MHis è normale, ma nei maschi è significativamente elevato. Questo dato, e considerazioni che vedremo nel seguito, hanno portato gli Autori a ipotizzare che:

  • nei maschi con ME/CFS si ha lo stesso blocco dell’enzima PDH ipotizzato nelle donne, e le proteine contenute nei loro muscoli vengono disassemblate e utilizzate per alimentare il ciclo del TCA.

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Figura 3. Gli amminoacidi delle categorie I, II e III, con i loro punti di ingresso nel metabolismo energetico. I valori di alcuni metaboliti intermedi del ciclo del TCA sono ridotti nella ME/CFS. L’enzima aconitasi (aconitase, in inglese) è sovra espresso. Da (Fluge O et al. 2016) e (Yamano E, et al. 2016), con modifiche.

Norvegia vs Giappone

Cosa succederebbe allora se si misurassero direttamente i metaboliti del ciclo del TCA, come il citrato, l’alfa-chetoglutarrato etc? Cosa si aspetterebbe il lettore? La logica vorrebbe che questi metaboliti siano tutti ridotti, infatti se l’organismo si vede costretto a consumare amminoacidi al posto del glucosio, significa che il ciclo del TCA è inadeguatamente alimentato. Purtroppo lo studio norvegese non prevede la misura dei metaboliti del ciclo del TCA, ma qualcuno forse ricorderà che quei metaboliti sono stati misurati in un studio giapponese (Yamano E, et al. 2016). Avevo discusso quello studio in un mio precedente articolo. Nella figura 3 ho aggiunto i risultati dello studio giapponese allo schema proposto da Fluge e Mella. Come potete vedere i metaboliti del ciclo del TCA sono ridotti, e la riduzione è particolarmente significativa nel caso del citrato, dell’isocitrato e del malato. In definitiva, lo studio di Fluge e Mella è in accordo con quello di Yamano e complessivamente possiamo affermare che:

  • c’è un blocco del rifornimento di Acetil-CoA nei mitocondri da parte della glicolisi, quindi i mitocondri cercano di alimentarsi con amminoacidi (Fluge Ö et al. 2016), ma nonostante questo tentativo, la produzione energetica dei mitocondri resta deficitaria (Yamano E, et al. 2016).

Norvegia, Giappone e la reumatologia di Pisa

In un mio precedente articolo (vedi qui) ho discusso i risultati di uno studio europeo che ha visto la collaborazione di ricercatori italiani, inglesi e tedeschi, e di 45 pazienti ME/CFS della reumatologia di Pisa (Ciregia F et al 2016). Gli Autori hanno dimostrato – in questi pazienti – la sovraespressione di due enzimi mitocondriali: la subunità beta dell’enzima ATP sintetasi (ATPB) e la aconitasi mitocondriale (ACON). Il secondo enzima in particolare catalizza un passaggio metabolico del ciclo del TCA, la reazione che dal citrato porta al cis-acotinato. Ho riportato la posizione di questo enzima nella figura 3, in azzurro. Quello che ci interessa qui osservare è che lo studio sulla espressione dell’ACON è in perfetta sintonia con quello norvegese, infatti:

  • una riduzione della alimentazione del ciclo del TCA comporterebbe una sovraespressione di vari enzimi che catalizzano le reazioni del ciclo, allo scopo di estrarre ogni goccia di energia possibile dal substrato disponibile.

Anche la sovraespressione di ATPB – che è un enzima chiave della catena respiratoria – è coerente con questo modello e lo conferma ulteriormente.

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Figura 4. I metaboliti intermedi del ciclo del TCA di Whitney Dafoe sono tutti ridotti a un mezzo del normale.

 E il paziente zero?

In un mio articolo sul metabolismo energetico di Whitney Dafoe (il ‘paziente zero’) (vedi qui) avevo discusso come i metaboliti intermedi del suo ciclo del TCA fossero tutti ridotti a circa la metà dl valore medio normale (vedi figura 4). Non sarebbe neanche necessario osservare, a questo punto, che questo profilo metabolico è coerente con lo studio giapponese, con quello norvegese e con i dati provenienti dai pazienti della reumatologia di Pisa.

Lo studio Naviaux

In accordo con il presente studio, anche Naviaux e colleghi hanno riportato una riduzione di leucina, isoleucina e valina, tanto nei maschi che nelle femmine con ME/CFS (Naviaux R et al. 2016).

Conclusione

Lo studio norvegese suggerisce che la glicolisi non rifornisca di acetil-coA il ciclo del TCA in modo adeguato, per questo i mitocondri bruciano amminoacidi al posto del glucosio (catabolisi degli amminoacidi). Nelle donne gli amminoacidi sono sottratti al flusso sanguigno, nei maschi sono prelevati dai muscoli. Lo studio norvegese è in accordo con un precedente studio giapponese e con i dati del metabolismo di Whitney Dafoe, che riportano una complessiva riduzione dei metaboliti intermedi del ciclo del TCA. Anche la sovraespressione dell’enzima ACON, dimostrata nei pazienti della reumatologia di Pisa, è coerente con una alimentazione inadeguata del ciclo del TCA.

Dove fare gli esami?

Gli esami metabolici possibili al momento sono di due tipi: il profilo degli amminoacidi (come nello studio norvegese) oppure l’analisi diretta dei metaboliti intermedi del ciclo del TCA (come nello studio giapponese, e come nell’esempio di Whitney Dafoe). Ecco alcune indicazioni.

  1. Il profilo amminoacidico utilizzato da Fluge e Mella (figura 2) è disponibile in molti ospedali italiani (Bambin Gesù di Roma, Ospedale di Udine, Policlinico Umbero I di Roma etc), e può essere eseguito sia sul sangue (come nel caso dello studio norvegese) che su urine. L’esame sul sangue probabilmente fornisce una istantanea del metabolismo energetico medio di ogni cellula del corpo. L’esame delle urine può fornire altri dati, ma al momento non ho idee chiare sul loro significato. Questo esame sembra particolarmente indicato nelle donne, nei maschi potrebbe essere normale.
  2. Per quanto riguarda invece gli esami di metaboliti intermedi del ciclo del TCA, al momento non mi risulta siano disponibili negli ospedali italiani, ma sono offerti da questo laboratorio spagnolo, e probabilmente da altri laboratori europei di cui non sono a conoscenza. Per ulteriori informazioni rimando a questo mio articolo. Questo esame dovrebbe essere significativo tanto per le donne che per gli uomini.

La parola a Fluge e Mella

In questo video della televisione norvegese – con sottotitoli in inglese – gli autori dello studio commentano i loro risultati. Olav Mella – in particolare – sottolinea verso la fine del servizio che loro ritengono che la disfunzione alla base della ME/CFS sia reversibile.

Il prezzo dell’energia

Il prezzo dell’energia

Introduzione

Diversi lavori hanno fin qui dimostrato, nei soggetti ME/CFS, un insolito utilizzo dei sistemi anaerobici di produzione dell’energia. Discuterò questo argomento citando alcuni studi e portando come esempio, per fissare le idee, le misure effettuate sul mio stesso metabolismo energetico. Proporrò infine un possibile modello teorico per la post-exertional malaise.

Neutrofili in apnea

Nel 2009 e nel 2012 Myhill e colleghi pubblicarono i risultati di alcune misurazioni del metabolismo energetico dei neutrofili estratti dal sangue periferico di complessivi 200 pazienti ME/CFS. Tra le varie osservazioni fatte, di particolare interesse è il riscontro di un gruppo di pazienti, denominato dagli autori gruppo B, in cui la frazione di energia prodotta anaerobicamente risultava particolarmente elevata rispetto al controllo sano (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012). Io sono risultato appartenere a questo gruppo, infatti i miei neutrofili contano per il 23% sulla sintesi anaerobica di energia, quando normalmente questa quota non dovebbe superare l’11%. Questa iperproduzione anaerobica sembra un tentativo di compenso per la scarsa produzione aerobica di energia, che appare tuttavia velleitario. Infatti nel mio caso, e nel caso di tutti gli altri pazienti studiati da Myhill e colleghi, la sintesi di ATP era deficitaria. E’ importante notare che l’iperattività del sistema energetico anaerobico, rilevato nei neutrofili da Myhill, è stata recentemente confermata nelle cellule mononucleari (linfociti e monociti) del sangue periferico di pazienti ME/CFS, da un gruppo di ricercatori della Stanford University e della Columbia University (Lawson N et al. 2016). Il dato dunque si estende ad altre cellule, ed acquista un valore più universale.

Hai voluto la bicicletta?

Diversi studi hanno valutato le prestazioni fisiche dei pazienti ME/CFS durante il test ergospirometrico. In questo test il paziente viene posto su una cyclette e invitato a pedalare contro una resistenza crescente. Una mascherina collegata con dei tubi a dei sensori, misura lo scambio di ossigeno e anidride carbonica del soggetto con l’esterno, mentre degli elettrodi rilevano la sua attività cardiaca. Senza entrare nei dettagli, questi esperimenti hanno dimostrato che per erogare la stessa potenza, i pazienti ME/CFS utilizzano meno ossigeno dei controlli sani, ovvero fanno maggiore affidamento sui sistemi anaerobici di produzione della energia. Questo fenomeno si acutizza se il test viene ripetuto in due giorni consecutivi (Vanness, 2007), (Snell, 2013). Nel mio caso il volume di ossigeno consumato per Watt erogato al test ergospirometrico è minore di 9 ml/W, e questo depone appunto per un sistema aerobico inefficiente e per un sistema anaerobico iperattivo. E’ bene notare che, mentre le misure sui neutrofili dimostrano un problema del sistema aerobico solo in un tipo di cellula (il neutrofilo appunto), il test ergospirometrico conferma questo difetto a livello sistemico.

Dove si trova il guasto?

Uno scenario possibile nella ME/CFS è che il sistema aerobico di produzione di energia delle cellule sia difettoso, e che i sistemi anaerobici (sono almeno tre, vedi seguito) siano iperattivi, come tentativo di compenso. Ma dove si trova il difetto del sistema aerobico? Varie ipotesi sono possibili. Qui vorrei discuterne una che è stata proposta durante la conferenza IACFS/ME 2016, tenutasi in Florida in Ottobre. Il gruppo norvegese avrebbe proposto in quella sede un modello teorico in cui un qualche difetto al livello dell’enzima piruvato deidrogenasi (che trasforma il piruvato in acetil-CoA) impedisce il collegamento tra la glicolisi e il ciclo di Krebs. Questa ipotesi è particolarmente affascinante perché si sposa egregiamente sia con il lavoro di W. Armstrong sul catabolismo degli ammino acidi (Armstrong W et al. 2015) che con quello di Yamano sulla depressione della parte iniziale del ciclo di Krebs (Yamano E et al. 2016). Nel mio caso, senza entrare nei dettagli, ho verificato un consumo di diversi amminoacidi non essenziali, coerente con quello descritto da Armstrong. Questo significa che nelle mie cellule probabilmente si sta cercando di ossidare gli aminoacidi al posto dell’acetil-CoA, che forse non viene approvigionato per un problema al livello del piruvato deidrogenasi, in accordo con la teoria norvegese.

Il prezzo dell’energia anaerobica

Abbiamo visto sin qui che le mie cellule cercano di compensare un difetto del sistema aerobico di energia, potenziando il sistema anaerobico, oltre che tentando di ossidare gli amminoacidi. Ma quali sono i sistemi anaerobici di produzione di energia? Sono almeno tre, e li riassumo nel seguto.

  1. La glicolisi è il più conosciuto, e produce 2 molecole di ATP per ogni molecola di glucosio. Il prezzo da pagare per questo tipo di produzione di energia è la sintesi di lattato, una molecola tossica che il metabolismo deve prendersi l’onere di smaltire.
  2. L’idrolisi della fosfocreatina, con la quale viene liberato un fosfato inorganico per ogni molecola di fosfocreatina (Livingstone C et al. 2001).  La conseguenza di un uso eccessivo di questo percorso metabolico sarebbe la riduzione della creatina plasmatica, secondo Armstrong (Armstrong W et al. 2015), anche se non mi è chiaro il perché.
  3. La fusione di due molecole di ADP, con la formazione di una molecola di ATP e una di AMP, attraverso l’enzima adenilate chinasi. L’AMP è ulteriormente degradato in IMP e ammonio (NH3) (Livingstone C et al. 2001) e l’IMP viene ancora smembrato, producendo adenosina (Salway JG 2004).

Questi tre sistemi sono poco efficienti (sono sistemi primitivi, soppiantati dalla invenzione evolutiva dei mitocondri) e un loro utilizzo eccessivo, come visto, impone un prezzo metabolico da pagare. Usando il mio metabolismo come esempio, emergerebbe un uso eccessivo dei sistemi 2 e 3. Infatti non è mai risultato nel mio caso, se non in un paio di misurazioni, un accumulo eccessivo di lattato. Risulta invece una deplezione della creatina plasmatica (sistema 2) e un leggero accumolo di ammonia (sistema 3).

Adenosina e crash

Abbiamo visto che il mio ciclo di Krebs sembra non ricevere adeguato approvigionamento di acetil-CoA, e per compensare ossida amminoacidi. Abbiamo anche visto un altro tentativo di compenso, attraverso il sovrautilizzo di due sistemi anaerobici di produzione di energia, la idrolisi della fosfocreatina e la fusione di due ADP per formare una molecola di ATP. Questo secondo meccanismo in particolare, comporta la sintesi di ammonio, che è neurotossico, e di adenosina. L’adenosina è una molecola che presenta diversi recettori in vari tessuti. Se in particolare stimola il recettore A2a, la conseguenza è vasodilatazione (calo pressorio) (McVey MJ et al. 1999) e depressione del sistema dopaminergico nel sistema nervoso centrale (Schiffmann SN et al. 2007).

Ipotesi

Nel mio caso, il minimo sforzo fisico, a volte anche solo il fatto di restare seduto per alcune ore, causa un episodio di acutizzazione dei sintomi, che può durare da un giorno ad alcune settimane. Questi episodi sono caratterizzati da ipotensione ortostatica e letargia, con profonda confusione. Se ammettiamo che il mio metabolismo faccia affidamento in modo particolarmente elevato al terzo meccanismo di sintesi anaerobica della energia descritto più sopra, allora potrebbe aversi una produzione anomala di adenosina. Questa sostanza potrebbe causare vasodilatazione e depressione della trasmissione dopaminergica, e quindi costituire la base fisiologica di miei crash. Bisogna tuttavia menzionare il fatto che nello studio metabolomico di Robert Naviaux l’adenosina è stata misurata, e mentre nei maschi non è risultata alterata, nelle femmine è addirittura più bassa del normale (non più alta) (Naviaux R et al. 2016). Quindi al momento non esistono dati sperimentali a sostegno di questa ipotesi. Resta tuttavia plausibile, per me e per altri pazienti, lo scenario in cui un ciclo di Krebs ipoattivo (forse perché le sue vie di rifornimento sono bloccate) porta a un aumento della sintesi anaerobica di energia con uno o più dei sistemi anaerobici indicati. Ciascuno di essi è poco efficiente e richiede un prezzo metabolico da pagare.

Approfondimenti

  • Studio di Myhill e colleghi sui mitocontri dei neutrofili (qui).
  • Studio di Yamano e colleghi sul ciclo di Krebs (qui).
  • Studio metabolico di un paziente (qui).

Glicolisi e amminoacidi

Glicolisi e amminoacidi

In questa figura riporto la rappresentazione classica delle nove tappe della glicolisi, con in più delle reazioni che legano gli amminoacidi glicina, serina e alanina al metabolismo del glucosio. Questi percorsi metabolici, qui semplificati e incompleti, sono di grande utilità nella valutazione delle malattie metaboliche: ad esempio un aumento di glicina può indicare una patologia mitocondriale, mentre un difetto di alanina potrebbe costituire un indizio per un blocco della glicolisi, etc. Gli enzimi sono rappresentati in giallo, le tappe della glicolisi sono in blu, mentre gli amminoacidi sono in verde. Alcune frecce, che rappresentano una reazione chimica, devono intendersi anche nel verso opposto rispetto a quello indicato, infatti in presenza di un eccesso del prodotto finale, molte di queste reazioni si possono invertire.

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Le nove tappe della glicolisi e il rapporto del metabolismo dello zucchero con alanina, glicina e serina. Disegno di Paolo Maccallini, da fonti varie.

Mitocondri inglesi, il test ‘ATP profile’

Mitocondri inglesi, il test ‘ATP profile’

Introduzione

Il lavoro di Naviaux e colleghi della University of San Diego sull’ipometabolismo nella ME/CFS, ha fornito dati convincenti a favore di una riduzione del metabolismo energetico in questa patologia (Naviaux R et al. 2016). Una interpretazione analoga è stata suggerita sulla base di un diverso set di dati da uno studio precedente (Armstrong CW et al. 2015) e da uno successivo (Yamano E, et al. 2016), mentre arrivano conferme ufficiose di questa ipotesi da Olav Mella (Universitetet i Bergen, Norvegia) e da Maureen Hanson (Cornell University, USA). Infatti sia i norvegesi che la Cornell University hanno riferito di studi (non ancora pubblicati) che confermano l’ipometabolismo.

A volte ritornano, l’epopea dei neutrofili

In questo contesto mi sembra allora utile riesumare una serie di tre studi pubblicati tra il 2009 e il 2013 da un gruppo inglese costituito dal fisico Norman Booth, dal medico Sarah Myhill, e da McLaren-Howard (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012), (Myhill S et al. 2013). In questi lavori gli autori dimostrarono una complessiva depressione del metabolismo energetico dei neutrofili estratti dal sangue periferico di 71 pazienti con diagnosi di ME/CFS (criteri Fukuda) e presentarono un test, denominato ‘ATP profile’, in grado non solo di separare completamente i soggetti malati dai 53 controlli sani, ma anche di predire il livello di disabilità dei pazienti, espresso in termini di scala di Bell, un indice numerico sviluppato dal dr. David Bell. Gli esperimenti di Myhill e colleghi non sono stati mai replicati da un altro gruppo, e inoltre riguardano solo i neutrofili. Tuttavia oggi sappiamo, come detto, che tutte le cellule del corpo presentano un difetto energetico nella ME/CFS. Quindi sembra possibile che ciò che trovarono nei neutrofili sia un dato reale ed estendibile a tutte le cellule del corpo. Pertanto descrivo in quanto segue il test ‘ATP profile’ (che consta della misura di diversi parametri) e i risultati degli studi di Myhill e colleghi, alla luce delle nuove scoperte.

Il test ‘ATP profile’

Il test si basa sulla misura dell’ATP sia all’interno dei neutrofili che all’interno dei mitocondri dei neutrofili, in diverse condizioni sperimentali. I neutrofili furono estratti dal sangue periferico di 71 pazienti e 53 controlli sani nel primo esperimento (Myhill S et al. 2009). In un secondo lavoro, la misurazione fu effettuata su un secondo gruppo di 138 pazienti (cohort 2) mentre i dati del primo esperimento furono riesaminati, dopo aver escluso 10 pazienti con età non compresa tra i 18 e i 65 anni, ottenendo così un campione di 61 persone (cohort 1) (Booth, N et al 2012). La misura del contenuto di ATP si basa su una metodica sviluppata nell’immediato dopoguerra (McElroy WD, 1947). In quello che segue descrivo il test, così come è presentato nello studio del 2009, e discuto i risultati di un soggetto che si è sottoposto all’esame.

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Figura 1. La catena respiratoria (Cohen BH, Gold DR. 2001).

Contenuto di ATP nei neutrofili. Viene misurata la concentrazione di ATP in presenza di eccesso di magnesio (ATP^Mg_1) e viene espressa in nano moli per milione di neutrofili (Myhill S et al. 2009). Nel caso che portiamo come esempio si ha:

ATP^Mg_1 = 1.38 nmol/(10^6 cell.)          [1.6-2.9]

Oltre a questa misura di ATP, se ne effettua una seconda, senza aggiunta di magnesio. La indichiamo ATP e nel nostro esempio vale:

ATP = 0.84 nmol/(10^6 cell.)              [0.9-2.7]

Gli autori calcolano poi il rapporto tra la seconda e la prima misura (Myhill S et al. 2009). Nel nostro paziente abbiamo:

ATP/ATP^Mg_1 = 0.53              [>0.65]

Gli Autori rilevano che il controllo sano presenta un valore medio di questo rapporto di 0.686 con una deviazione standardi di 0.032, e suggeriscono che il basso valore di questo rapporto nei pazienti sia indice di una carenza di Mg intracellulare. Questa carenza ha conseguenze fisiologiche importanti poiché il Mg è un elemento essenziale affinché l’enzima ATPase svolga la sua funzione, che è quella di ricavare energia dalla degradazione di ATP in ADP  (Booth, N et al 2012).

Glicolisi. Si inibisce la catena respiratoria utilizzando azoturo di sodio, il quale blocca sia l’enzima ATP sintetasi (complesso V in figura 1) che il citocromo a3 (complesso IV in figura 1). A questo punto viene meno la respirazione e i neutrofili consumano rapidamente lle riserve di ATP. Dopo alcuni minuti viene misurato il contenuto di ATP dei neutrofili (Myhill S et al. 2009). Detto ATP^Mg_2 questo valore, nel nostro esempio si ha:

ATP^Mg_2 = 0.32 nmol/(10^6 cell.)          [<o.3]

Gli Autori osservano che nei neutrofili dei soggetti sani l’inibizione dlla catena respiratoria porta a un rapido crollo dell’ATP a un valore pari al 7.5% del valore iniziale, con una deviazione standard di 3.4%. Questo sembra coerente con la possibilità che il metabolismo dei neutrofili sotto l’effetto dell’azoturo di sodio sia sostenuto solo dalla glicolisi (Booth, N et al 2012). In effetti la glicolisi produce due molecole di ATP per molecola di glucosio, mentre il ciclo di Krebs accoppiato alla respirazione ne produce 36, di cui 2 in condizioni anaerobiche. Dunque con inibzione della respirazione si avrebbe una riduzione teorica della sintesi di ATP a 4/34, ovvero 12% circa di quanto prodotto in condizioni aerobiche. Quindi il parametro:

ATP_ini = (ATP^Mg_2/ATP^Mg_1)

si può considerare una misura del contributo della sintesi anaerobica di energia. Nel caso del nostro paziente si ha:

ATP_ini = 0.232            [0.04-0.11]

Come riferimento, in questo caso, ho usato la media più o meno una deviazione standard, piuttosto che i valori forniti nel referto.

Respirazione. L’azoturo di sodio viene rimosso e si misura nuovamente il contenuto di ATP nei neutrofili, dopo un intervallo di tempo assegnato (3 minuti). Questa misura fornisce il valore ATP^Mg_3 e gli Autori riportano che a inibizione rimossa, il livello di ATP nei neutrofili del controllo sano aumenta a un 60-90% del valore iniziale ATP^Mg_1. A questo punto introducono il rapporto:

OxPhos = (ATP^Mg_3-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1-ATP^Mg_2)

che propongono come una misura della efficienza della respirazione (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012). Nel nostro esempio si ha:

ATP^Mg_2 = 0.32 nmol/(10^6 cell.)          [<o.3]

ATP^Mg_3 = 0.87 nmol/(10^6 cell.)          [>1.4]

Si ottiene allora:

    OxPhos = (ATP^Mg_3-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1-ATP^Mg_2) = 0.519        [>60]

Purtroppo, a mio parere, OxPhos è piuttosto una misura della capacità della catena di trasporto degli elettroni di riprendersi dalla inibizione con azoturo di sodio, quindi una generica misura della salute della catena di trasporto. Come misura del contributo della ossidazione alla produzione di energia propongo invece il parametro:

ATP_oss = ( ATP^Mg_1-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1) = 1 – ATP_ini

Nel nostro caso si ha

ATP_oss = 0.768            [0.89-0.96]

Come riferimento, in questo caso, ho usato la media più o meno una deviazione standard, piuttosto che i valori forniti nel referto.

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Figura 2. ADP/ATP translocasi (Bos taurus), da Protein Dat Bank, ID 10KC, con modifiche. In blu la superficie dlla membrana interna del mitocondrio (che si affaccia sulla matrice), in rosso la superficie che si affaccia sullo spazio compreso tra membrana mitocondriale interna e membrana mitocondriale esterna.

ADP/ATP translocasi. Questo enzima (riportato come ANT in figura 1) permette l’ingresso dell’ADP all’interno della matrice mitocondriale, dove viene convertito in ATP dall’enzima ATP sintetasi (complesso V in figura 1). ANT si estende tra la superficie esterna e la superficie interna della membrana interna dei mitocondri (figura 2). Presenta quattro isoforme negli esseri umani (ADT1, ADT2, ADT3, ADT4) probabilmente tessuto-specifiche. Il trasferimento di ADP e ATP è molto dispendioso e richiede il 25% della energia prodotta dalla respirazione (Kilngerberg M, 2008). Se l’enzima ANT non funziona correttamente, ne risulta una inibizione della catena di trasporto degli elettroni, del piruvato deifrogenasi (che converte il piruvato in Acetil-CoA), e di tutto il ciclo di Krebs (Pieczenik SR, Neustadt J, 2006).

Misura della efficienza di ADP/ATP translocasi. Durante l’esecuzione dell’ATP profile alcuni mitocondri vengono estratti dai neutrofili e il loro contenuto di ATP viene misurato. Detto ATPmito_1 questo valore, nel caso del nostro soggetto si ha:

ATPmito_1 = 225 pmol/(10^6 cell.)          [290-700]

dove ‘cell’ non si riferisce più ai neutrofili, ma ai mitocondri. Inoltre in questo caso la misura è in pico moli, cioè 10^(-12) moli. A questo punto un secondo campione di mitocondri è immerso in un bagno di ADP in modo da indurre l’enzima ANT a far entrare ADP nei mitocondri. Segue una nuova misura dell’ATP mitocondriale, che indichiamo ATPmito_2. Nel nostro esempio si è misurato il seguente valore:

ATPmito_2 = 290 pmol/(10^6 cell.)          [410-950]

Ci si aspetta un aumento di ATP perché l’ADP è uno degli ingredienti fondamentali per la sua sintesi. Nel nostro soggetto l’aumento è minimo, e questo viene interpretato dagli Autori come una scarsa capacità dell’enzima ANT di far entrare ADP nel mitocondrio. A questo punto il pH di una terza coltura di mtocondri è modificato (portato a 8.9 ± 0.2) in maniera da favorire la fuoriuscita di ATP dai mitocondri, sempre attraverso l’enzima ANT. Il contenuto di ATP dei mitocondri è quindi nuovamente misurato, fornendo il parametro ATPmito_3, che nel nostro soggetto è:

ATPmito_3 = 194 pmol/(10^6 cell.)          [140-330]

Da queste misure gli autori ricavano i seguenti due quozienti:

TL_out = (ATPmito_2-ATPmito_1)/ATPmito_1

TL_in = (ATPmito_3-ATPmito_1)/ATPmito_1

Il primo valore è proposto come una misura della efficienza di ANT nel traslocare ADP dal citoplasma a dentro i mitocondri; il secondo rapporto fornirebbe invece una misura della efficienza dello stesso enzima nel traslocare ATP dai mitocondri, dove è prodotto, al citoplasma (Myhill S et al. 2009).  Nel caso portato come esempio si ha

TL_out = 0.289        [>0.35]

TL_in = 0.138        [55-75]

Mitochondrial energy score. Gli autori hanno proposto un indice che riassume l’efficienza del sistema energetico dei mitocondri, chiamato Mitochondrial Energy Score (MES). Questo indice è stato definito in modo diverso nello studio del 2009 e in quello del 2012. Noi ci rifaremo alla definizione proposta nel primo studio, perché per quella del 2012 non vengono fornite tutte le indicazioni necessarie per effettuare il calcolo. La definizione è:

mes

dove 0,182 è il più basso valore che il prodotto a numeratore raggiunge nel controllo sano. Per il nostro paziente si ha:

MES = 0,0151/0,182 = 0,083

Gli autori associarono a ciascuno dei 71 pazienti il relativo indice MES e l’indice di Bell, riportando poi per ciascuno di essi un punto in un piano avente come ascissa l’indice di Bell e come ordinata il MES (vedi figura 3). Calcolarono poi la retta di regressione dei dati, la quale fornisce una funzione che permette di predire l’inidice di Bell, noto che sia il MES. Questa funzione si ricava facilmente dal grafico in figura 3 ed è data da:

Indice di Bell = 1 + 7,5MES

Per il nostro paziente restituisce un indice di Bell di 1.6, quindi diciamo 2. Questo corrisponde a 20 nella scala di Bell (che è dieci volte il valore di quello che abbiamo chiamato qui indice di Bell). Riporto la descrizione dei valori 20-30 della scala di Bell:

  • 20. Sintomi da severi a moderati a riposo. Incapace di svolgere attività impegnative. Incapace di lasciare casa, se non raramente. Confinato a letto per la maggior parte del tempo. Incapace di concentrarsi per più di un’ora al giorno. Funzionalità complessiva al 30-50% del normale.
  • 30. Sintomi da severi a moderati a riposo. Sintomi severi dopo qualunque tipo di esercizio. Generalmente confinato a casa. Incapace di svolgere qualunque attività impegnativa. Capace di svolgere lavoro al tavol per 2-3 ore al giorno, con bisogno di periodi di riposo. Funzionalità complessiva al 50%.

Il soggetto in effetti si colloca esattamente a questo livello di funzionamento, e questa è stata la qualità della sua vita per la maggior parte della sua annosa malattia, con brevi oscillazioni verso livelli maggiori di funzionamento. Si osservi che la funzionalità complessiva riportata nella scala di Bell è un indice che vuole tener conto anche delle funzioni organiche più semplici, come respirare e digerire; non è misura della produttività del soggetto.

mes-2
Per ciascun paziente si riporta un punto sul piano che ha in ascissa l’indice di Bell (che è dato dal valre sulla scala di Bell, diviso 10) e il MES in ordinate. E’ evidenziata in rosso la retta di regressione e i punto che individuano i tre pazienti portati come esempio (Myhill S et al, 2009). Sono evidenziati in rosso i punti relativi ai tre pazienti discussi in questo testo.

Le due ME/CFS

Booth e colleghi notarono che i pazienti della coorte 2 si distinguevano in due gruppo ben diversi fra loro. In un gruppo ricadevano pazienti con una attività glicolitica elevata (ATP_ini basso) e nell’altro coloro con una valore normale di questo parametro. Fu possibile inoltre notare che il primo gruppo presentava una ridotta funzione di trasporto dell’ATP fuori dai mitocondri (LT_in basso), mentre il secondo gruppo presentava un LT_in più alto del normale. Entrambi i gruppi presentano un basso trasporto di ADP dentro i mitocondri (vedi figura 4.A, 4.B, 4.C). In definitiva è possibile distinguere nella ME/CFS i seguenti due gruppi:

  • Gruppo HI Blk: individui con una respirazione particolarmente compromessa (ATP_oss basso), una compromisione del trasporto di ATP fuori dai mitocondri (TL_in basso) e di ADP dentro i mitocondri (TL_out basso);
  • Gruppo HI TL_in: individui con un normale equilibrio fra respirazione e glicolisi (ATP_oss normale), una iperattività del trasporto di ATP fuori dai mitocondri (TL_in alto) e una compromisione del trasporto di ADP dentro i mitocondri (TL_out basso).

Il paziente del nostro esempio appartiene al gruppo HI Blk, mentre gli altri due pazienti discussi nel seguito appartengono all’altro gruppo (vedi figura 4.A). Gli autori suggeriscono che la riduzione della respirazione nel gruppo HI Blk sia causata dal blocco di ANT nella funzione di trasporto di ATP fuori di mitocondri (Booth L et al. 2012). Nel gruppo HI Blk si potrebbe pensare che vi sia un blocco complessivo dell’enzima ANT, genetico o epigenetico. Nel gruppo HI TL_in invece abbiamo un’iperattività di questo enzima la quale potrebbe rappresentare un qualche meccanismo di compensazione. E’ bene ricordare che ANT si trova a cavallo della membrana interna del mitocondrio, e dunque attinge ADP dallo spazio fra membrana esterna e mebrana interna. Questo permette di formulare la seguente ipotesi:

  • Nel gruppo HI TL_in qualcosa nello spazio fra le due membrane del mitocondrio interferisce con l’interazione fra ADP e ANT. Questo porta a una sovra esepressione di questo enzima, come misura di compenso, che si manifesta come un aumento del trasporto di ATP fuori dalla matrice mitocondriale da parte di ANT stesso.
tl-in
Figura 4. Nella cohort 2 di distinguono due gruppi di pazienti ben differenziati. Uno, nominato Hi TL IN, presenta un valore più alto del normale di TL IN associato a un normale ATP_oss; l’altro, nominato Hi Blk, presenta un basso TL IN associato a un basso ATP_oss (Booth L et al. 2012). In figura sono riportate anche le coordinate dei tre pazienti esaminati. Il pz. 1 appartiene al gruppo Hi Blk, gli altri due al gruppo Hi TL IN.

L’origine del blocco

Gli Autori suggeriscono che l’umento di TL_in sia dovuto a una mancanza di substrato della catena respiratoria, ovvero ADP, fosfato inorganico, CoQ10, NADH, Mg. La mancanza di ADP potrebbe essere dovuta a sua volta al blocco di ANT nella sua funzione di trasporo di ADP dal citoplasma ai mitocondri, infatti l’89% del gruppo HI TL_in presenta un basso valore di TL_out (figura 4). Da notare che anche il gruppo HI Blk presenta in buona parte (78%) un basso LT_out (figura 4). Complessivamente tutti i pazienti della coorte 2 presentano almeno una delle due vie di trasporto bloccate. Questo induce gli autori a pensare che l’enzima ANT svolga un ruolo centrale nel determinare la disfunzione mitocondriale alla base della ME/CFS. Tra le possibili origine del blocco dell’enzima ANT gli Autori menzionano i seguenti fattori:

  • prodotti del metabolismo di virus o batteri;
  • sostanze di scarto prodotte da un danno ai tessuti;
  • sostanze chimiche di origine ambientale (Booth L et al. 2012).
mes-3
Figura 5. Sono riportati i dati del paziente usato come esempio (paziente 1), e di altri due pazienti (paziente 2 e paziente 3). In arancio sono riportati i valori sopra la norma, in azzurro quelli sotto la norma. Nella colonna a destra si riporta inoltre il significato di ciascuna misura. I parametri usati per il calcolo del MES (secondo lo studio del 2009) sono 1, 3, 8, 12, 13. Nello studio del 2012 il parametro 13 fu sostituito dal 6.

Tre pazienti

Riporto sinteticamente i dati del paziente che abbiamo discusso sopra (paziente uno) e di altri due pazienti (vedi figura 5). Discuto ora brevemente i tre casi.

Paziente 1. Si possono fare le seguenti osservazioni.

  • Complessivamente la sintesi di ATP è poco efficiente, come suggeriscono i valori ATP^Mg_1 e ATPmito_1, entrambi bassi.
  • Il rapporto tra ATP senza aggiunta di magnesio e ATP con aggiunta di Mg (valore 3 in figura 4) è basso, e questo suggerisce probabilmente una insufficienza di Mg intracellulare  (Booth, N et al 2012).
  • Esiste uno sbilancio fra la glicolisi e la respirazione (ATP_in alto) che probabilmente riflette un blocco della respirazione. Questo sembra giustificare il valore complessivamente basso dell’ATP intracellulare.
  • La catena respiratoria ha uno scarso recupero dallo stress chimico costituito dall’azoturo di sodio (OxPhos basso).
  • Si nota la capacità estremamente ridotta di ANT di traslocare ATP fuori dai mitocondri. Infatti si ha una riduzione relativa del 13,8% tra ATPmito_3 e ATPmito_1, dove normalmente si registra una riduzione fra 55 e 75%. Questo probabilemnte giustifica il fatto che la misura ATPmito_3 sia nella norma. Infatti dopo la rimozione del bagno di ADP, l’ATP fatica a uscire dal mitocondrio e rimane all’interno.
  • Anche il trasporto di ADP dentro i mitocondri è inibito (LT_out basso) e quindi si può dire che complessivamente l’enziam ANT è poco funzionale.
  • Carenza di magnesio intracellulare, bassa attività di respirazione, elevata sensibilità della catena respiratoria a stress chimici, e blocco dell’enzima ANT sono in accordo con un MES di solo 0.083, che si traduce in un 20 della scala di Bell, ovvero una condizione di ME/CFS severa.
  • Scala di Bell: 20. Sintomi da severi a moderati a riposo. Incapace di svolgere attività impegnative. Incapace di lasciare casa, se non raramente. Confinato a letto per la maggior parte del tempo. Incapace di concentrarsi per più di un’ora al giorno. Funzionalità complessiva al 30-50% del normale.

Paziente 2.  Si possono fare le seguenti osservazioni.

  • Complessivamente la sintesi di ATP è poco efficiente, come suggeriscono i valori ATP^Mg_1 e ATPmito_1, entrambi bassi.
  • Il rapporto tra ATP senza aggiunta di magnesio e ATP con aggiunta di Mg (valore 3 in figura 4) è basso, e questo suggerisce probabilmente una insufficienza di Mg intracellulare  (Booth, N et al 2012).
  • I valori ATP_ini e ATP_oss sono normali, a indicare un buon equilibrio tra glicolisi e respirazione.
  • La catena respiratoria ha uno scarso recupero dallo stress chimico costituito dall’azoturo di sodio (OxPhos basso).
  • Spiccata la capacità di ANT di traslocare ATP fuori dai mitocondri. Infatti si ha una riduzione relativa del 77,5% tra ATPmito_3 e ATPmito_1, dove normalmente si registra una riduzione fra 55 e 75%. Questo alto valore di TL_in contribuisce a migliorare il MES del paziente. E’ plausibile pensare che questa sovra attivazione dell’enzima ANT sia una forma di compensazione per la inadeguata capacità del soggetto di sintetizzare ATP (ATP^Mg_1 e ATPmito_1 bassi).
  • Il trasporto di ADP dentro i mitocondri è inibito (LT_out basso) e forse contribuisce al difetto di ATP intracellulare del soggetto.
  • Carenza di magnesio intracellulare, elevata sensibilità della catena respiratoria a stress chimici, e blocco dell’enzima ANT nel trasporto di ADP dentro i mitocondri, contribuiscono a determinare un MES di 0.57, che si traduce in un 50 della scala di Bell, ovvero una condizione di ME/CFS moderata.
  • Scala di Bell: 50. Sintomi moderati a riposo. Sintomi da severi a moderati dopo esercizio o attività. Incapace di svolgere mansioni impegnative, ma può svolgere lavori leggeri o lavoro al tavolo per 4-5 ore al giorno, avendo però bisogno di periodi di riposo. Funzionalità complessiva al 70% del normale.

Paziente 3.  Non ci sono sostanziali differenze con il profilo del paziente 2.

Confronto con altri studi

In una recente pubblicazione italo-tedesca su due gemelli omozigoti, uno dei quali con ME/CFS (l’atro sano), l’enzima ADP/ATP translocasi risulta sotto espresso nel fratello malato, rispetto al fratello sano (Ciregia F et al 2016). Questa ridotta espressione potrebbe essere la causa del complessivo scarso funzionamento dell’enzima nel gruppo HI Blk, oppure potrebbe essere una misura di compenso per il funzionamento eccessivo della traslocazione di ATP fuori dai mitocondri rilevata nel gruppo HI TL_in. Difficile fare ipotesi, ma questa coincidenza è interessante.

Due recenti studi metabolomici hanno apparentemente individuato quelli che sembrano essere due diversi tipi di ME/CFS. In uno è stata descritta una anomalia metabolica caratterizzata da lattato elevato e da un difetto nel ciclo di Krebs (Yamano E, et al. 2016); in un altro invece si è riportato un difetto della glicolisi, con ridotto piruvato e lattato (Armstrong CW et al. 2015). Si potrebbe speculare che i pazienti descritti da Yamano appartengano al gruppo HI Blk, mentre quelli descritti da Armstrong siano del tipo HI LT_in.

Test ergospirometrici eseguiti due giorni di seguito sui pazienti ME/CFS, hanno dimostrato nella prova del secondo giorno che la soglia anaerobica entra precocemente e in definitiva i pazienti consumano meno ossigeno per erogare un watt, rispetto a un soggetto normale (anche sedentario) (Vanness, 2007), (Snell, 2013). Quindi i pazienti farebbero maggiore affidamento sul sistema anaerobico per produrre energia, esattamente come il gruppo HI Blk.

Approfondimenti

Mitocondri giapponesi e le due ME/CFS

Mitocondri giapponesi e le due ME/CFS

Pazienti, campioni e strumentazione

In un recentissimo studio giapponese (Yamano E, et al. 2016) 67 adulti con diagnosi di ME/CFS (criteri Fukuda) e 66 controlli sani sono stati sottoposti a un dettagliato esame metabolico. Il loro sangue periferico è stato analizzato attraverso un particolare tipo di spettroscopia di massa (capillar electrophoresis timo-of-flight mass spectrometry, CE-TOFMS) in grado di individuare 144 metaboliti distinti nel medesimo campione. Tra queste molecole ne sono state individuate in particolare 31, relative alla glicolisi, al ciclo di Krebs (o ciclo dell’acido tricarbossilico, TCA), e al ciclo dell’urea (vedi figura 1).

mitocondri giapponesi.png
Figura 1. Livelli di alcuni metaboliti della glicolisi, del ciclo di Krebs e del ciclo dell’urea nei pazienti ME/CFS e nel controllo sano (Yamano E. et al. 2016).

Glicolisi

Ricordo che la glicolisi avviene nel citoplasma (fuori dai mitocondri) e permette di ricavare due molecole di ATP da ogni molecola di glucosio. Lo scarto della glicolisi consiste in due molecole di piruvato, per ciascuna molecola di glucosio processata. I ricercatori giapponesi hanno rilevato come unica anomalia di questa parte iniziale del metabolismo energetico, un aumento del suo prodotto finale, ovvero del piruvato (vedi figura 1). Ciò nonostante, il glucosio e il lattato vengono mantenuti in parametri normali, probabilmente grazie a una serie di sistemi di compensansione.

Ciclo di Krebs

Ricordo che il piruvato è il carburante che alimenta la seconda fase del metabolismo energetico, che si verifica all’interno dei mitocondri. In questa seconda fase, il piruvato è convertito in Acetil-CoA (con la sintesi di 3 molecole di ATP per ciascun piruvato), e l’Acetil-CoA è poi inviato al ciclo di Krebs (o ciclo dell’acido citrico), dove sono prodotte altre 12 molecole di ATP per ogni molecola di Acetil-CoA. Più precisamente, il ciclo di Krebs produce una molecola di ATP, tre di NADH e una di FADH2; queste due ultime molecole vengono inviate alla fosforilazione ossidativa (membrana dei mitocondri) dove sono utilizzate per sintetizzare complessivamente 11 molecole di ATP. I ricercatori giapponesi hanno rilevato una complessiva riduzione dei metaboliti del ciclo di Krebs, ma in particolare la depressione riguarda la parte iniziale, ovvero il citrato e l’isocitrato.

Il ciclo dell’urea

Ricordo che il ciclo dell’urea si occupa di smaltire i rifiuti del metabolismo degli amminoacidi, producendo urea a partire da ammoniaca (NH3). Nello studio giapponese è stato riscontrato un aumento di ornitina, e una sensibile riduzione di citrullina.

Un test metabolico per la CFS

In base a quanto sopra, gli Autori dello studio hanno concluso che i cinque metaboliti ornitina, citrullina, piruvato, lattato, e isocitrato sono quelli che con maggiore evidenza possono rappresentare il difetto metabolico dei pazienti ME/CFS. In particolare i ricercatori hanno riscontrato come la combinazione di valori alti per i due rapporti ornitina/citrullina e piruvato/isocitrato  fornisca un test per discriminare i pazienti ME/CFS dal controlo sano (vedi figura 2).

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Figura 2. Il rapporto piruvato/isocitrato (glicolisi e ciclo di Krebs) e il rapporto ornitina/citrullina (ciclo dell’urea) discriminano tra ME/CFS e controllo sano (Yamano E. et al 2016).

Dove sta il problema?

Secondo Yamano e colleghi, l’analisi di questi dati suggerisce un qualche difetto nei passaggi che vanno dal piruvato all’isocitrato. Ovvero il blocco metabolico si estende tra l’ingresso del piruvato nei mitocondri e la parte iniziale del ciclo di Krebs. I ricercatori affermano espressamente che:

la ridotta concentrazione dei metaboliti della fase iniziale del ciclo di Krebs verosimilmente rappresenta il processo patologico alla base della fatica.

Giappone vs Italia

Uno studio europeo che ha indagato l’espressione di due enzimi mitocondriali nella saliva di pazienti ME/CFS reclutati dall’Ospedale santa Chiara di Pisa, ha riportato recentemente una alta espressione di due enzimi chiave del metabolismo mitocondriale, ovvero la subunità beta della ATP sintetasi (ATPB, complesso V in figura 3) e l’aconitasi mitocondriale (ACON) (Ciregia F et al 2016). Una mia sintesi di questo studio è disponibile qui. Quello che ci interessa in questa sede è rilevare una certa coerenza fra lo studio europeo e quello giapponese, infatti se ammettiamo che il ciclo di Krebs è bloccato nella sua fase iniziale, possiamo immaginare che il sistema cercherà di compensare aumentando l’espressione di alcuni o tutti gli enzimi a valle del blocco, al fine di estrarre ogni possibile risorsa dal substrato disponibile. Ora si dà il caso che ACON è proprio l’enzima che catalizza la reazione da citrato a isocitrato. Mentre ATPB fa parte del complesso enzimatico con cui culmina la catena respiratoria, con sintesi di ATP da ADP. Si ravvisa dunque un possibile accordo fra i due studi, e questo è un ottimo segno.

Giappone vs Australia

Nel 2015 uno studio australiano sul metabolismo della ME/CFS (Armstrong CW et al. 2015) ha rilevato dati per molti aspetti opposti rispetto a quelli riportati da Yamano e colleghi. Infatti gli australiani hanno dedotto l’esistenza di un blocco della glicolisi (a monte del piruvato) dalla ridotta abbondanza di piruvato e lattato (esattamente il contrario di quanto riportato dai giapponesi) e hanno riscontrato l’uso di amminoacidi come fonte alternativa di carburante nel ciclo di Krebs. Da notare anche che per gli australiani il rapporto ornitina/citrullina è ridotto nella ME/CFS rispetto ai controlli sani, non aumentato! Tuttavia è interessante rilevare che un blocco della glicolisi produrrebbe comunque un blocco del ciclo di Krebs, quindi in entrambe le condizioni descritte il quandro clinico sarebbe probabilmente lo stesso. E sia lo studio australiano che quello giapponese sono coerenti con quello sui pazienti toscani.

Giappone vs Inghilterra

Tra il 2009 e il 2013 un gruppo inglese costituito dal fisico Norman Booth, dal medico Sarah Myhill, e da McLaren-Howard ha prodotto una serie di studi sui mitocondri dei neutrofili estratti dal sangue periferico di pazienti ME/CFS (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012), (Myhill S et al. 2013) in cui dimostrarono una complessiva perdita di efficienza di questi organelli, in parte riconducibile a un difetto dell’enzima ADP/ATP translocator (ANT in figura 3), specialmente nella sua funzione di esportazione di ATP da dentro i mitocondri al citoplasma. Sorprendentemente questo enzima è sottoespresso, secondo lo studio sui pazienti italiani. Tuttavia questo dato non permette di dedurre nulla di particolare sul ciclo di Krebs, e quindi non è possibile fare un confronto fra gli studi inglesi e quello giapponese e australiano.

ANT.png
Figura 3. La catena respiratoria (Cohen BH, Gold, DR, 2001).

Giappone vs California

In un precedente post ho provato a discutere i dati metabolici di Whitney Dafoe, il figlio del celebre genetista Ronald Davis (Stanford University), il quale è stato sottoposto per primo a un nuovo test metabolmico, uno dei più completi esistenti (circa 400 metaboliti). Quello che risulta dal suo test è una complessiva inibizione sia della glicolisi che del ciclo di Krebs. In questo caso dunque si ha un paziente che rientrerebbe nel profilo descritto dagli australiani, e non in quello descritto dai giapponesi, anche se non è possibile fare un confronto diretto con lo studio australiano, che non prevede l’analisi diretta dei metaboliti del TCA.

Tutte le strade portano alla ME/CFS

Si deve ammettere che lo studio giapponese non è coerente con quello australiano, tuttavia emerge una possibilità: che i due studi abbiano descritto due diversi difetti metabolici (blocco della parte iniziale del TCA nel primo, e della glicolisi nel secondo) che portano entrambi allo stesso quadro clinico, ovvero alla ME/CFS. Infatti tanto in un caso, che nell’altro, si avrebbe una depressione dl ciclo di Krebs. In entrambi i casi si avrebbe poi un quadro compatibile con la sovra espressione degli enzimi ATPB e ACON (studio europeo). Quest’ultimo studio riporta poi una sotto espressione dell’enzima ANT, che sembra disfunzionale negli studi inglesi. Il caso di Whitney è in fine compatibile con lo studio australiano. L’esito finale è in ogni caso una deplezione di ATP che può ben essere la causa di deficit cognitivi, della post-exertional malaise, della fatica a riposo, e della POTS. Ovvero di ciò che chiamiamo comunemente ME/CFS.

Conclusione e prospettive

In conclusione, sembrano essere almeno due le strade metaboliche che portano alla ME/CFS. Una mia ricerca, attualemnte in corso e basata per il momento sui dati di soli due pazienti, potrebbe spiegare entrambe questi difetti metabolici, attraverso un fenomeno autoimmune. Basta infatti considerare che…

Il bicchiere mezzo pieno

Il bicchiere mezzo pieno

Il paziente zero

All’inizio di questo anno si è tenuta a San Francisco l’edizione 2016 della Personalized Medicine World Conference (PMWC) (programma). Durante la prima giornata dei lavori, il dr. Andreas Kogelnik, medico e bioingegnere presso l’Open medicine Institute, ha presentato alcuni dei dati relativi al metabolismo energetico di un giovane uomo affetto da ME/CFS, come esempio di applicazione delle nuove indagini metabolomiche in patologie difficili e ancora sconosciute. Il paziente in questione è il figlio di Ronald Davis, genetista presso la Stanford University attualmente impegnato nella ricerca sulla ME/CFS e sulla Lyme cronica, presso l’Open Medicine Foundation. E’ lo stesso Kogelnik a rivelare nel suo intervento l’identità dell’uomo di cui discute i dati metabolici, e d’altra parte le sfortunate vicende di questo ragazzo sono state rese pubbliche dalla sua stessa famiglia, anche allo scopo di incentivare la ricerca scientifica e l’investimento per la ME/CFS. Chi fosse interessato, trova un toccante racconto del progressivo declino intellettivo e fisico di Whitney (questo è il suo nome), in questo video e in quest’altro.

Un fotografo e la foto del suo metabolismo

Whitney, che ora ha approssimativamente 35 anni, da alcuni anni non è più in grado di spostarsi dal suo letto, di leggere, e di comunicare con i suoi genitori. In passato è stato un apprezzato fotografo e ha girato il mondo. Questo è il suo sito personale. L’ultimo aggiornamento (2013) dice: “Molto malato. Non posso parlare. Non posso scrivere abbastanza per comunicare. Non intrattengo una conversazione con qualcuno da sei mesi…” Whitney è un caso singolare, sia perché ha una manifestazione particolarmente grave di ME/CFS (ma ci sono altri pazienti come lui), sia perché suo padre è un professore di genetica presso una delle migliori università del mondo (Stanford University). E cosa può fare un papà-scienziato per salvare un figlio affetto da una condizione incurabile? Studia, certo! Ma non si limita a perlustrare compulsivamente le pubblicazioni scientifiche o i libri di biologia; mette in piedi un’intera squadra di ricercatori, cerca fondi per finanziarli, e inventa nuove tecnologie, per combattere la malattia. Nel video dell’intervento di Andreas Kogelnik possiamo vedere i primi risulatati del suo sforzo. In particolare al minuto 8 abbiamo una eloquente istantanea del metabolismo energetico di Whitney (vedi figura).

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Il livello di alcuni metaboiti della glicolisi e del ciclo di Krebs di Whitney, tratti dal video dell’intervento di Andreas Kogelnik, durante l’edizione 2016 della PMWC.

Joule e glucosio

Prima di esaminare i dati metabolici di Whitney, ricordo brevemente che il processo attraverso il quale le nostre cellule estraggono energia dai legami chimici del glucosio, consiste in due fasi. La prima, la glicolisi, avviene nel citoplasma (fuori dai mitocondri) e permette di ricavare due molecole di ATP da ogni molecola di glucosio. Lo scarto della glicolisi consiste in due molecole di piruvato, per ciascuna molecola di glucosio processata. Ma questo sottoprodotto è il carburante che alimenta la seconda fase, che si verifica all’interno dei mitocondri. In questa seconda fase, il piruvato è convertito in Acetil-CoA (con la sintesi di 3 molecole di ATP per ciascun piruvato), e l’Acetil-CoA è poi inviato al ciclo di Krebs (o ciclo dell’acido citrico), dove sono prodotte altre 12 molecole di ATP per ogni molecola di Acetil-CoA. Più precisamente, il ciclo di Krebs produce una molecola di ATP, tre di NADH e una di FADH2; queste due ultime molecole vengono inviate alla fosforilazione ossidativa (membrana dei mitocondri) dove vengono utilizzate per sintetizzare complessivamente 11 molecole di ATP. La conclusione è che una molecola di glucosio permette di produrre 2 molecole di ATP nel citoplasma, più 36 molecole all’interno dei mitocondri. Questi sono i rudimenti del bilancio energetico delle cellule. La questione si complica quando si considera che anche gli acidi grassi e alcuni amminoacidi sono utilizzati dai mitocondri per produrre energia.

Metà non basta

Cosa ci dice l’istantanea del metabolismo energetico di Whitney? Nel momento in cui si tiene conto del fatto che i dati sono stati normalizzati rispetto presumibilmente alla media aritmetica del controllo sano, emerge che il suo generatore funziona a circa metà della potenza media. Infatti, il piruvato (prodotto finale della glicolisi) è circa 0.6 del valore medio, e tutti i metaboliti del ciclo di Krebs sono compresi tra 0.4 e 0.7. Coerentemente, il livello di glucosio nel sangue è leggermente aumentato (il pancreas di Whitney riesce a evitare l’iperglicemia, evidentemente), mentre quello del lattato è altrettanto basso (il lattato è prodotto dal piruvato).  Ora, se il generatore cellulare di energia eroga una potenza (energia liberata per unità di tempo) pari al 50% di quello che normalmente l’organismo produce, ci si può aspettare che a soffrirne maggiormente siano gli organi con il più alto fabbisogno energetico, come il cervello e i muscoli. E questo modello teorico, basato sui dati reali della termodinamica di Whitney, spiegherebbe i suoi sintomi. Certamente altre interpretazioni sono possibili!

Fuori dal circolo di Krebs

Ma dove si trova il blocco del generatore cellulare del paziente zero? Se la glicolisi funziona al 50% e se è la glicolisi ad alimentare i mitocondri, la risposta sembra semplice: il blocco è nel citoplasma, cioè nella glicolisi stessa, fuori dai mitocondri. Questa interpretazione dei dati è coerente con quanto dimostrato da Christopher Armstrong e dai suoi colleghi della Università di Melbourne, nel 2015. Il gruppo di ricerca è stato infatti in grado di evidenziare un blocco della glicolisi, analizzando il normale pannello degli acidi organici nel sangue e nelle urine di 34 pazienti affetti da ME/CFS (Armstrong CW et al. 2015). L’ipotesi di un blocco della glicolisi è compatibile altresì con il recente lavoro europeo sui pazienti della reumatologia di Pisa, in cui è stata dimostrata una sovra espressione di due fondamentali enzimi mitocondriali (vedi questo post). Infatti, se i mitocondri vengono sottoposti a una riduzione dell’approvigionamento di carburante, è logico pensare che aumenteranno il numero di enzimi per estrarre ogni possibile joule dal substrato disponibile. La mia tuttavia è una semplificazione, infatti il ciclo di Krebs viene alimentato anche da carburante alternativo al piruvato, come alcuni amminoacidi e gli acidi grassi. Quindi il  ragionamento è riduttivo e non conclusivo.

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Whitney, da questa pagina.

Ipometabolismo come adattamento

Un’altra possibile spiegazione per la complessiva depressione del sistema energetico (fuori e dentro i mitocondri) è quella fornita da Robert Naviaux, nella sua recente pubblicazione sul metabolismo della ME/CFS. Secondo la sua visione, i mitocondri vengono parzialmente spenti, come risposta a una minaccia ambientale persistente (principalmente infezioni o sostanze tossiche); questa risposta è un meccanismo evolutivamente conservato, il cui ruolo è quello di proteggere l’organismo dalla minaccia, un po’ come la febbre è un sistema di difesa che favorisce la risposta immunitaria contro un virus o un battere. Se questo fosse vero, il blocco dei mitocondri dovrebbe essere gestito in concerto con un blocco della glicolisi, altrimenti si avrebbe l’accumolo di sostanze tossiche, come il lattato. Anche questa ipotesi si adatta bene ai dati sperimentali relativi a Whitney.

Conclusione

Il metabolismo del paziente zero, ovvero del primo paziente ME/CFS soggetto a una approfondita analisi metabolica secondo le nuove tecnologie disponibili, rivela un complessivo dimezzamento della potenza erogata dai generatori di energia delle sue cellule. Apparentemente il difetto è nella parte iniziale del metabolismo del glucosio, fuori dai mitocondri, e si riverbera ovviamente sul metabolismo mitocondriale, che risulta depresso. Tuttavia altre interpretazioni di questi dati sono possibili, come quella dell’ipometabolismo proposta da Naviaux e colleghi. Inoltre, sebbene una riduzione della energia del 50% sembrerebbe spiegare i sintomi, non è possibile affermare che questa riduzione sia la causa della patologia, piuttosto che una sua semplice conseguenza.