L’influenza che non passa mai

L’influenza che non passa mai

Introduzione

In tre miei articoli precedenti (qui, qui e qui) – a commento del recente lavoro pubblicato da Fluge e colleghi (Fluge O et al. 2016) – ho descritto uno scenario in cui una funzione ridotta dell’enzima piruvato deidrogenasi (PDH) nei pazienti ME/CFS porta a una inefficiente sintesi di energia in seno al ciclo del TCA. La ridotta funzione del PDH è stata dedotta dalla presenza di un fenomeno di catabolismo degli amminoacidi, e dalla sovra espressione degli enzimi piruvato deidrogenasi kinasi (PDK), in particolare le isoforme 1, 2, 4. Ora la domanda è: cosa causa questa alterazione metabolica? Gli Autori, sulla scorta del loro successo terapeutico con il Rituximab, ipotizzano che un autoanticorpo possa – in alcuni pazienti – attivare o disattivare dei circuiti legati alla regolazione del metabolismo energetico. In quanto segue propongo uno scenario alternativo, basato su uno studio su topi con l’influenza.

Primo atto: influenza A e piruvato deidrogenasi

Nel 2014 un gruppo giapponese (Yamane K et al. 2014) ha inoculato il virus della influenza A (IAV) in topi da laboratorio, e nei 7 giorni successivi ha condotto uno studio sulle cavie malcapitate, simile a quello eseguito da Fluge e Mella sui pazienti ME/CFS, se non per il fatto che i topi sono stati sacrificati in modo da poter effettuare le misure direttamente nei tessuti. Come si vede in figura 1.A, l’attività del piruvato deidrogenasi si riduce col passare dei giorni nei vari tessuti esaminati, con la sola eccezione del cervello. Contestualmente (figura 1.B) anche il livello di ATP scende (ovunque, tranne che nel cervello). Questa prima parte dell’esperimento si può considerare equivalente alla prima parte dello studio di Fluge e Mella, quella che ho discusso qui. Cambia il tipo di misure effettuate, ma il risultato è lo stesso: il metabolismo energetico è depresso e si ha una perdita di attività del piruvato deidrogenasi.

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Figura 1. Attività dell’enzima piruvato deidrogenasi in vari tessuti (A) e concentrazione di ATP nei medesimi tessuti (B).

Secondo atto: piruvato deidrogenasi kinasi, il solito sospetto

Esattamente come Fluge e Mella, anche i ricercatori giapponesi si sono chiesti se una espressione genica insolitamente alta degli enzimi piruvato deidrogenasi kinasi (ce ne sono quattro, indicati PDK1, PDK2…) potesse essere responsabile della ridotta attività del piruvato deidrogenasi. Infatti questi quattro enzimi hanno proprio la funzione di inibire il pirvato deidrogenasi. Come si vede in figura 2, il PDK4 aumenta rapidamente col passare dei giorni sia nel cuore, che nei polmoni, così come nel fegato e nei muscoli scheletrici.

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Figure 2. Espressione del PDK4 in vari tessuti, in funzione dei giorni contati a partire dal momento in cui è stato inoculato il virus dell’influenza.

Questo secondo esperimento è simile agli esperimenti sulla espressione genica nelle cellule mononucleari del sangue periferico, effettuati dal gruppo di Fluge e Mella sui pazienti ME/CFS (qui). Anche in quel caso si è trovata una sovra espressione del PDK4, ma anche del PDK1 e 2, che invece nei topi sono normali. Comunque esiste una sovrapponibilità fra i due risultati.

Uomini e topi

In base a quanto visto, durante i primi 7 giorni dalla inoculazione del virus della influenza A, i topi cominciano a sviluppare una disfunzione metabolica simile a quella descritta da Fluge e Mella nei pazienti ME/CFS: un aumento del piruvato deidrogenasi kinasi si associa a una perdita di funzione del piruvato deidrogenasi e a un complessivo decadimento del metabolismo energetico. Questo cosa significa? E’ difficile trarre conclusioni, ma potremmo forse azzardare l’ipotesi che:

  • la alterazione metabolica descritta nella ME/CFS altro non è che quella che si verifica durante una infezione, a partire già dal primo giorno.

Poichè i primi anticorpi (classe IgM) si formano solo una o due settimane dopo l’inizio della infezione, possiamo escludere che le alterazioni osservate nei topi siano da imputare agli anticorpi. Gli stessi autori le attribuiscono a varie citochine (vei figura 3).

immunometabolismo
Figura 3. Il virus della influenza induce la sintesi di citochine che, a loro volta, attivano la sovra espressione di PDK che inibisce il piruvato deidrogenasi.

Questo significa che una possibile ipotesi per il difetto del piruvato deidrogenasi nella ME/CFS può essere semplicemente la presenza di una infezione cronica, in accordo con quanto suggerito da Antony Komaroff, fra gli altri (vedi qui). Ovviamente questa è solo una fra le tante ipotesi possibili.

E il rituximab?

Se gli anticorpi non c’entrano, allora perché il farmaco rituximab – che uccide le cellule B che esprimono il CD20 – ha un effetto terapeutico in più di metà dei pazienti ME/CFS? Questa è un’ottima domanda, se si potesse rispondere alla quale saremmo più vicini alla soluzione. Tuttavia si consideri che le cellule B non sono solo fabbriche di anticorpi, ma sono anche prensentatori di antigeni, produttrici di citochine (Frances E. Lund 2009) e rilasciano DNA mitocondriale (dati non pubblicati, anticipati da Anders Rosén in questo video, minuto 14:16) esattamente come i mastociti (Zhang et al. 2012). Si ritiene che il DNA mtocondriale sia fortemente infiammatorio (infatti assomiglia a quello di un battere) e quindi potrebbe essere la causa di diversi disturbi (Zhang et al. 2012), tra cui anche magari la disregolazione del piruvato deidrogenasi. Quindi l’effetto del rituximab nella ME/CFS non è necessariamente legato alla presenza di autoanticorpi.

Conclusione

Abbiamo visto che l’alterazione metabolica recentemente ipotizzata nella ME/CFS (Fluge O et al. 2016) è presente anche durante i primi 7 giorni di una infezione virale. Quindi il detto comune secondo il quale “la CFS è come una influenza che non passa mai” sembra corretto anche da un punto di vista metabolico, e potrebbe avere un potere descrittivo ben più profondo di quanto si sia potuto immaginare fino ad oggi.

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Mitocondri norvegesi, terzo atto: qualcosa nel sangue

Mitocondri norvegesi, terzo atto: qualcosa nel sangue

Per una lettura veloce andare direttamente ai paragrafi 7 e 8.

1.Introduzione

Nei precedenti due articoli (qui e qui) sul lavoro pubblicato da Fluge, Mella e collaboratori (Fluge et al. 2016) abbiamo visto che:

  • qualcosa induce l’espressione di una serie di meccanismi che riducono la funzione del piruvato deidrogenasi, costringendo i pazienti ME/CFS a bruciare amminoacidi al posto dello zucchero. Ma dei sistemi di compenso intervengono per cercare di riportare il metabolismo energetico alla normalità, senza riuscirci. I sistemi di compenso sono diversi fra maschi e femmine, ma il difetto metabolico a monte è lo stesso nei due sessi.

All scopo di individuare la molecola (o le molecole) a cui ricondurre l’origine di questa disfunzione, il gruppo di scienziati ha preparato delle colture di cellule umane provenienti da muscoli scheletrici, e le ha esposte al siero di 12 pazienti ME/CFS e di altrettanti controlli sani. Le colture cellulari sono state poi sotToposte a due tipi di misure:

  1. il livello di consumo di ossigeno (OCR, oxygen consumption rate), che indica il livello di attività dei mitocondri;
  2. il livello di acidificazione dello spazio extracellulare (ECAR, extracellular acidification rate) che è una misura surrogata del livello di acido lattico prodotto.

Entrambi i parametri sono stati misurati sia in presenza di glucosio, che in presenza di amminoacidi. Nel complesso sono state fatte misure in quattro condizioni sperimentali.

2.Primi due esperimenti: amminoacidi e glucosio

Le cellule muscolari a riposo – esposte al siero dei pazienti – e coltivate in presenza di amminoacidi, presentano un consumo di ossigeno maggiore delle cellule esposte al siero di controlli sani (figura1, B.I). Aggiungendo il glucosio (figura 1, B.II), la situazione non cambia: ancora la respirazione delle cellule muscolari esposte al siero dei pazienti è maggiore di quella delle cellule muscolari esposte al siero di controlli sani. La sintesi di acido lattico non differisce fra le cellule esposte a siero di pazienti e cellule esposte a siero di controlli sani (figura 1, D.I e D.II).

coltura celulare 2.jpg
Figura 1. Consumo di ossigeno e nei quattro esperimenti (B) e sintesi di acido lattico (D).

3.Terzo esperimento: blocco dell’enzima ATP sintasi

Il blocco dell’enzima ATP sintasi, il quale si occupa di convertire ADP in ATP alla fine della catena respiratoria, riduce drammaticamente il consumo di ossigeno in entrambe le colture, ma quella con siero di pazienti è meno colpita (figura 1, B.III). Vale la pena ricordare che la subunità beta dell’enzima ATP sintasi è sovra espressa nei pazienti ME/CFS (vedi qui), e questo potrebbe essere legato all’effetto benefico del siero dei pazienti in questo esperimento. La produzione di lattato in questo esperimento è maggiore nelle cellule esposte a siero di pazienti (figura 1, D.III).

4.Quarto esperimento: blocco della catena respiratoria

I ricercatori hanno esposto le colture cellulari a una molecola (la CCCP) che inibisce la catena respiratoria. Come forma di compenso le colture cellulari aumentano drasticamente il consumo di ossigeno ma la coltura esposta al siero ME/CFS consuma più ossigeno (figura 1, B.IV) e produce più lattato (figura 1, D.IV).

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Figura 2. Sottrazioni fra misure effettuate negli esperimenti su coltura cellulare.

5.Sottrazioni

I ricercatori hanno poi effettuato i seguenti calcloli, i cui risltati sono riportati in figura 2:

  • consumo di ossigeno dell’esperimento II meno quello dell’esperimento III (figura 2, E);
  • consumo di ossigeno dell’esperimento IV meno quello dell’esperimento III (figura 2, E);
  • produzione di acido lattico dell’esperimento II meno quello dell’esperimento I (figura 2, F);
  • produzione di acido lattico dell’esperimento III meno quello dell’esperimento II (figura 2, F);
  • produzione di acido lattico dell’esperimento IV meno quello dell’esperimento II (figura 2, F).

6.Cosa ci dicono questi esperimenti?

Non è immediato dedurre il significato di questi esperimenti, almeno per me. Tuttavia possiamo dire quanto segue.

  • Il consumo di ossigeno delle cellule muscolari esposte al siero dei pazienti è maggiore di quello del gruppo di controllo (esperimenti I-IV), e questo è apparentemente in disaccordo con quanto risulta dai test ergosirometrici nella ME/CFS, in cui il consumo di ossigeno sistemico – per watt erogato – è minore nei pazienti (Vanness, 2007), (Snell, 2013).
  • Stressando chimicamente la catena respiratoria (esperimenti III e IV) la produzione di acido lattico aumenta nella coltura esposta a siero di pazienti più di quanto non aumenti nel contollo. Forse questo è il dato più interessante, che potrebbe rispecchiare un blocco nel piruvato deidrogenasi indotto dal siero dei pazienti nella coltura cellulare.

7.Conclusioni

Gli esperimenti in vitro di Fluge e colleghi dimostrano che nel siero dei pazienti ME/CFS è presente un fattore X (non noto) che:

  1. aumenta la capacità delle cellule di consumare ossigeno;
  2. aumenta la produzione di lattato in condizioni di aumentato fabbisogno energetico (simulate in provetta con inibitori della catena respiratoria).

La prima osservazione può indicare – secondo gli autori – la presenza di meccanismi di compenso attivati da messaggeri chimici contenuti nel sangue dei pazienti, che potenziano l’attività mitocondriale. La seconda osservazione sperimentale è in accordo con lo studio di Armstrong, che non rileva un aumento del lattato basale (Armstrong CW et al. 2015), e con osservazioni del gruppo norvegese (non ancora pubblicate) che indicano un aumento significatico di lattato dopo esercizio, rispetto ai controlli sani. L’aumento di lattato a seguito di esercizio è ciò che ci si aspetterebbe in presenza di un blocco del piruvato deidrogenasi. Quindi il fattore X (o i fattori?) contenuto nel siero dei pazienti è responsabile di due azioni, apparentemente opposte: da un lato potenzia i mitocondri, dall’altro fa aumentare la produzione di lattato. Questo potrebbe voler dire che:

  • nel siero dei pazienti è presente sia la causa dell’inibizione del piruvato deidrogenasi, che un fattore di compenso, che cerca di porre rimedio al difetto metabolico.

Questa è solo una delle interpretazioni possibili, ovviamente. Aggiungo che un aumento significativo del lattato dopo attività fisiche blande era stato segnalato in un precedente studio su un solo paziente, realizzato dal paziente stesso (Mark Vink 2015).

8.Un possibile test

Come abbiamo visto, nella ME/CFS il lattato basale sembra normale (Armstrong CW et al. 2015) e lo studio di Fluge e Mella – qui discusso – conferma questa dinamica anche con esperimenti in vitro. Tuttavia, a seguito di stress energetici, la produzione di lattato aumenta più di quanto ci si aspetterebbe normalmente, come già dimostrato da un paziente/ricercatore (Mark Vink 2015) e come evidenziato anche nello studio di Fluge e Mella, in vitro. Allora ho pensato che un possibile test in grado di rilevare questa dinamica metabolica potrebbe essere la misura di lattato e ammonio nel test da sforzo ischemico dell’avambraccio. In questo test viene fatta contrarre ripetutamente una mano del paziente (con una pallina morbida), essendo il flusso sanguigno bloccato con laccio emostatico. Dopo l’esercizio (che dura un minuto), diversi prelievi venosi vengono fatti nei successivi 10 minuti, con il laccio ancora stretto. Questi prelievi forniscono la produzione locale di lattato da parte dei muscoli scheletrici (Livingstone C et al. 2001). In figura 3 potete vedere l’esame di un paziente: il livello basale di lattato è perfettamente nella media, ma dopo 3 minuti la curva (in rosso) si discosta dal valore medio e sale oltre il valore massimo (anche se di poco). Questo tipo di andamento è coerente con quanto evidenziato in vitro da Fluge e Mella, e con la loro ipotesi sul piruvato deidrogenasi.

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Figura 3. Curva lattato, dopo sforzo ischemico dell’avambraccio. In rosso il livello di acido lattico del paziente, che da un valore perfettamente normale, sale superando il valore massimo (anche se di poco).

In questo test si misura anche l’ammonio, come verifica del fatto che il paziente si sia ‘impegnato’ nell’esecuzione dello sforzo. Infatti l’ammonio è un prodotto del metabolismo energetico (specialmente anaerobico), secondo le seguenti reazioni:

  1. 2ADP –> ATP + AMP
  2.   AMP –> IMP + NH3

9.Il cavaluccio marino

Le misure di cui ho parlato in questo articolo sono state effettuate con il dispositivo Seahorse XFe96 della Agilent. Questo apparecchio permette di misurare in tempo reale il metabolismo energetico cellulare (ad esempio di linfociti) attraverso una misura del consumo di ossigeno (che fornisce una stima semplice del funzionamento mitocondriale) e la produzione di protoni (che si può ritenere una misura della glicolisi), in varie condizioni sprimentali. Video esplicativo.

A comparison between four studies on energy metabolism in ME/CFS

A comparison between four studies on energy metabolism in ME/CFS

There is a European study that has checked for the expression of 1007 mitochondrial proteins in platelets from 2 twins, one with ME/CFS and the other one healthy (Ciregia F et al 2016). Of these proteins, 194 were significantly modified in the sick twin, in comparison with the healthy one. I have checked for differences in pyruvate dehydrogenase complex, ADP/ATP translocase subunits and pyruvate dehydrogenase kinases. This is what I have found in these two twins:

1) Pyruvate dehydrogenase E1 subunits alpha (PDHA) and beta are both increased in the sick twin, which is in partial agreement with the increase in PDHA found by Fluge and Mella (Fluge et al. 2016);

2) ADP/ATP translocase, sub unit 2 and 3, are low in the sick twin, compared with the healthy one, which could be in accordance with the study by Myhill and colleagues (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012), if only we assume that the problem with this enzyme found in group defined “HiBlk” is not due to blockage from a molecule or an autoantibody, but is instead due to under expression of the enzyme itself;

3) Pyruvate dehydrogenase kinases 1 and 3 are over expressed, which again is in partial agreement with what Fluge and Mella have found in their recent paper, where PDK 1, 2, 4 are over expressed in ME/CFS patients.

In conclusion, the sick twin does not seem to have any blockage of ADP/ATP translocase, because if that was the case he would present an over expression of the enzyme, while the enzyme is under expressed. On the other hand, he does seem to have a problem with his pyruvate dehydrogenase, in fact there is inhibition by over expressed PDK 1 and 3 and – at the same time – he is expressing more PDHA than his heathy twin.

The same European study (Ciregia F et al 2016) then selected three enzymes from the 194 significantly modified in the sick twin: ACON, ATPB e MDHM. They then evaluated the expression of these enzymes in a cohort of 45 Italian patients with ME/CFS and in 45 matched controls. In this case, they considered mitochondria from saliva. They found that both ACON and ATPB are over expressed in patients.

ACON stands for aconitase, which is an enzyme of the TCA cycle, that catalyzes the step from citrate to cis-aconitate (see figure). Thus, its over-expression in this cohort of patients is in agreement with the depletion of these two metabolites, found in a recent japanes study (Yamano E, et al. 2016) and with the study by Fluge and Mella: in fact, if we assume that the TCA cycle is poorly supplied by glycolysis, it would over express one or more enzymes in order to increase the energy production from the substrate available. Thus, this finding seems in agreement with both the Norwegian and the Japanese study, and seems to complete the picture.

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In this picture I have put together the levels of metabolites of the TCA from the japanese study and the picture used by Fluge and Mella in their metabolic study. I have indicated the function of aconitase in TCA cycle.

ATPB is subunit beta of ATP synthase, and it is involved in the last step of mitochondrial metabolism, the conversion of ADP into ATP. Again, an over expression of this enzyme seems to be in agreement with poor energy supply.

A discussion on these observation can be found in this thread in Phoenix Rising.

Mitocondri norvegesi, secondo atto: espressione genica

Mitocondri norvegesi, secondo atto: espressione genica

Per una sintesi si rimanda all’ultimo paragrafo.

Introduzione

Nel mio precedente articolo sullo studio pubblicato dal gruppo di Fluge e Mella, mi sono limitato a riportare i loro risultati sulla analisi dei 20 amminoacidi standard nel sangue dei pazienti ME/CFS. Riassumendo:

  • nelle donne con ME/CFS gli amminoacidi che si trasformano in acetil-CoA e quelli che alimentano direttamente il ciclo dell’acido citrico (ciclo TCA) sono ridotti;
  • nei maschi non si ha questa riduzione degli amminoacidi nel sangue, ma si ha un aumento della 3-metilistidina  (3-MHis), che suggerisce che i muscoli vengono smembrati (catabolizzati) per alimentare il ciclo del TCA. Nelle donne questo fenomeno è assente.

Gli autori hanno formulato allora la seguente ipotesi:

  • i pazienti ME/CFS (sia maschi che femmine) utilizzano gli amminoacidi per alimentare i mitocondri (il ciclo del TCA avviene dentro i mitocondri) più di quanto facciano i controlli sani.

I mitocondri – in condizioni normali –  usano come fonte principale di alimentazione lo zucchero. Lo zucchero – trasformato in piruvato fuori dai mitocondri (nella glicolisi) – viene ulteriormente trasformato in acetil-CoA dal PDH, e quindi alimenta il ciclo del TCA (vedi figura 1).

catabolismo
Figura 1. Rappresentazione semplificata del metabolismo energetico. Lo zucchero è trasformato in piruvato nella glicolisi, il piruvato è trasformato in acetil-CoA dal piruvato deidrogenasi (PDH). L’acetil-CoA entra nei mitocondri dove alimenta il ciclo del TCA. Si vedono anche i vari punti di ingresso degli amminoacidi nei percorsi metabolici.

Ciò posto, una possibile spiegazione per l’aumentato consumo degli amminoacidi da parte dei pazienti ME/CFS è che:

  • l’attività dell’enzima piruvato deidrogenasi (PDH) sia ridotta – per qualche motivo – e quindi l’approvigionamento di acetil-CoA è deficitario. In questo contesto, i mitocondri bruciano gli amminoacidi per produre energia, al posto dell zucchero.

Espressione genica

Per verificare l’ipotesi di un ridotto funzionamento del piruvato deidrogenasi (PDH), gli autori sono passati a un secondo gruppo di analisi, che sono l’oggetto del presente articolo. In particolare, il gruppo norvegese ha misurato l’RNA messaggero (l’espressione genica) di diversi geni che sono coinvolti nella regolazione della attività del PDK. L’espressione genica è stata misurata in un gruppo di cellule facilmente accessibili, ovvero le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). In pratica le PBMC sono: linfociti (cellule B, T, NK) e monociti (macrofagi). Ebbene, diversi geni coinvolti nella inibizione del piruvato deidrogenasi risultano sovra espressi, tanto nei maschi che nelle femmine con ME/CFS. Vediamo quali.

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Figura 2. Gli enzimi PDK1, PDK2 e PDK 4 (riquadri rossi) sono sovraespressi nella ME/CFS.

Piruvato deidrogenasi chinasi

L’enzima piruvato deidrogenasi chinasi (PDK) ha come principale funzione quella di inibire il PDH. Dunque una buona domanda da farsi è: quanto PDK è espresso nelle cellule delle persone con ME/CFS? Se l’attività del PDH è ridotta, ci si potrebbe aspettare che l’espressione del PDK sia aumentata. In effetti questo è proprio ciò che è stato trovato. Premesso che l’enzima PDK esiste in 4 varianti negli esseri umani (PDK1, PDK2 etc), i norvegesi hanno trovato che PDK1, PDK2 e PDK4 sono sovraespressi nei pazienti ME/CFS (sia maschi che femmine), come indicato in figura 2. La maggiore differenza fra pazienti e controllo sano riguarda il PDK1 (p = 0.0018), quindi gli autori hanno indagato ulteriormente l’espressione di questo enzima, scoprendo che:

  • il PDK1 è espresso maggiormente nelle donne che negli uomini (figura 3, M);
  • il PDK1 è tanto più espresso quanto più severa è la patologia (figura 3, N);
  • il PDK1 è espresso in modo maggiore in chi è malato da più di 10 anni (figura 3, O);
  • il PDK1 è espresso maggiormente in chi compie meno di 2200 passi al giorno (figura 3, P).

In condizioni di salute, l’aumento della espressione genica dei PDK (con conseguente inibizione del PDH) si verifica durante periodi di mancanza di cibo. Quindi – in un certo senso – i pazienti ME/CFS soffrono le conseguenze della mancanza di cibo, pur vivendo nella disponibilità di risorse alimentari.

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Figura 3. Livello del PDK1 in funzione del sesso dei pazienti (M), della severità della patologia (N), della durata della patolgia (O) e del numero di passi giornalieri (P).

PPARD

Fluge e Mella hanno esaminato – sempre nelle PBMC – l’espressione di una serie di altri geni, tra cui i geni PPARD (Peroxisome proliferator-activated receptor) che svolgono moltissimi ruoli nella regolazione del metabolismo cellulare, tra cui la regolazione del metabolismo degli zuccheri, dei carboidrati e delle proteine (Dunning, KR et al. 2014). I PPAR sono tre, ma tra questi l’unica differenza significativa tra pazienti e controllo sano è nel PPARD, che è sovra espresso nei pazienti (vigura 4, F). E’ interessante notare che PPARD controlla l’espressione genica del PDK4: infatti agonisti del recettore PPARD aumentano l’espressione genica del PDK4, nelle cellule muscolari umane (Abbot EL et al. 2005). Questo significa che una possibile catena di eventi è questa:

  • l’aumentata espressione di PPARD aumenta a sua volta l’espressione di PDK4, che inibisce il piruvato deidrogenasi.

Tuttavia questo è solo uno dei possibili percorsi regolatori coinvolti in questo complessi fenomeni.

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Figura 4. Il gene PPARD è sovraespresso.

Espressione di altri geni

Gli Autori norvegesi hanno indagato l’espressione di numerosi altri geni, trovando altre differenze fra controlli sani e pazienti. In particolare, il gene SIRT4 è sovra espresso (figura 5, K), così come il gene MPC1 e il gene per la subunità PDHA del PDH (figura 5, I e G). E’ interessante che questi tre geni siano strettamente legati fra loro, infatti la proteina codificata da SIRT4 inibisce la subunità PDHA del PDH, mentre MPC1 aumenta l’espressione genica di PDHA. Insomma, da un lato si inibisce questo pezzo del PDH e dall’altro si cerca di aumentarne il numero, per compensare!

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Figura 5. SIRT4 è sovraespressa (K), così come MPC1 (I) e PDHA (G).

Norvegia vs Pisa

Ho parlato più volte dell studio sulla espressione genica nei mitocondri dei pazienti ME/CFS della Reumatologia di Pisa (vedi qui). Ricordo che nella prima parte di quello studio si verificò l’espressione genica di 194 proteine mitocondriali in due gemelli, uno sano e uno con ME/CFS. In questo caso le cellule usate sono le piastrine, non le PBMC. Confrontando questi dati con quelli dello studio norvegese si osserva quanto segue.

  • La subunità PDHA (PDH E1-alpha) è sovra espressa sia nello studio norvegese (figura 5, G) che nel gemello con ME/CFS, che ne esprime 1.6 volte di più del fratello sano (Tabella S1); il gemello malato sovraesprime anche la subunità E1 beta.
  • la PDK1 e la PDK3 sono sovraespresse nel gemello malato (1.54 volte e 1.73 volte, rispettivamente) (Tabella S1). Nello studio norvegese ad essere sovraespresse sono la PDK1, la PDK2 e la PDK4 (figura 3), quindi esiste una discrepanza fra i due risultati.

Nel complesso si riscontrano dunque sia somiglianze che incongruenze fra questi due studi.

Cosa emerge?

Riassumo i punti salienti di quanto qui visto:

  1. i mitocondri consumano amminoacidi al posto dello zucchero per produrre energia, e questo fa pensare a un possibile blocco dell’enzima piruvato deidrogensi (PDH);
  2. una serie di enzimi che inibiscono il piruvato deidrogenasi (PDK1,2,4) sono effettivamente sovra espressi nei pazienti ME/CFS, rispetto ai controlli sani;
  3. una proteina (la PPARD) che aumenta l’espressione del PDK4 è sovra espressa nei pazienti ME/CFS;
  4. la proteina SIRT4, che inibische la subunità PDHA del PDH, è sovra espressa nei pazienti ME/CFS e, come forma di compenso, la subunità PDHA è sovra espressa, probabilemnte grazie alla sovra espressione di MPC1, che ha funzione regolatoria.

Detto in termini più semplici:

  • qualcosa induce l’espressione di una serie di meccanismi che riducono la funzione del piruvato deidrogenasi, costringendo i pazienti ME/CFS a bruciare amminoacidi al posto dello zucchero. Ma dei sistemi di compenso intervengono per cercare di riportare il metabolismo energetico alla normalità, senza riuscirci. I sistemi di compenso sono diversi fra maschi e femmine, ma il difetto metabolico a monte è lo stesso nei due sessi.

In un prossimo articolo riporterò la terza parte dello studio, che ha esaminato l’effetto del sangue dei pazienti su cellule umane in coltura. In quella sede torneremo sulle conclusioni da trarre da questi dati, e da quelli di altri studi.

Mitocondri norvegesi, primo atto: amminoacidi

Mitocondri norvegesi, primo atto: amminoacidi

L’antefatto

A fine ottobre, durante l’ultima IACFS/ME (una conferenza biennale che riunisce i maggiori esponenti della ricerca sulla ME/CFS) i due oncologi Öystein Fluge e Olav Mella dell’ospedale universitario di Bergen (Norvegia), avevano presentato dei risultati preliminari che sembravano evidenziare un difetto nel metabolismo energetico dei pazienti ME/CFS. Ma la parte più interessante del loro intervento consisteva nell’avere proposto una possibile origine di questo difetto, nell’avere cioè potuto localizzare la vera fonte dei problemi. Circa un mese dopo – a Stoccolma – Öystein Fluge aveva di nuovo stuzzicato la curiosità di pazienti e ricercatori, durante una seconda conferenza scientifica, senza però fornire dati precisi. Esiste un video di questo secondo intervento (qui). Fluge e Mella sono famosi nella comunità ME/CFS, e lo sono per un motivo sensato: hanno trovato un potenziale trattamento per più del 50% dei pazienti. Si tratta di un anticorpo monoclonale (Rituximab) che uccide la sottopopolazione di cellule B che esprime l’antigene CD20 sulla superficie. L’effetto della terapia è spesso temporaneo, ma in qualche caso la remissione è permanente (Fluge Ö et al. 2015). Sono due scienziati rispettati, e in Norvegia hanno ottenuto il sostegno del governo nella loro ricerca sulla ME/CFS. In definitiva, da ottobre è iniziata l’attesa per la pubblicazione che avrebbe svelato un possibile nodo centrale del difetto metabolico nella ME/CFS. Tuttavia i bene informati avevano già cominciato a bisbigliare un nome, a masticarlo nelle loro riflessioni; a evocarlo forse anche durante la loro vita onirica: piruvato deidrogenasi.

La pubblicazione, tre studi in uno

Lo studio è stato pubblicato il 22 dicembre sulla rivista JCI insight e si trova qui. Lo studio consiste in tre parti:

  1. una analisi di alcuni metaboliti rilevanti per il metabolismo energetico;
  2. uno studio di espressione genica di alcune proteine rilevanti nel metabolismo energetico;
  3. uno studio in vitro in cui cellule muscolari umane sono coltivate con siero dei pazienti.

In questo articolo illustrerò la prima parte dello studio, contestualizzando i risultati rispetto a due precedenti studi.

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Figura 1. Catabolismo degli amminoacidi. I percorsi metabolici lungo i quali gli amminoacidi alimentano il metabolismo energetico. Da (Fluge O et al. 2016), con modifiche.

Primo atto, amminoacidi e ciclo dell’acido citrico

Sono stati esaminati campioni biologici di 200 pazienti ME/CFS (162 donne e 38 maschi) e 102 controlli sani. La concentrazione dei 20 amminoacidi standard è stata misurata con l’uso di uno spettrometro di massa. Gli amminoacidi sono stati classificati in tre categorie, in funzione del loro punto di ingresso nei percorsi metabolici energetici (figura 1). Infatti in assenza di glucosio in persone sane, così come in particolari patologie metaboliche, gli amminoacidi possono essere ‘bruciati’ per produrre energia, in un processo detto catabolismo degli amminoacidi (Bryant Miles, 2004), (Salway JG 2004). I tre gruppi sono:

  1. Categoria I. Sono gli amminoacidi che vengono convertiti in piruvato: alanina (Ala), cisteina (Cys), glicina (Gly), serina (Ser), e treonina (Thr).
  2. Categoria II. Sono gli amminoacidi che vengono convertiti in acetil-coenzima A (acetil-CoA), e che dunque alimentano direttamente il ciclo dell’acido citrico (TCA): isoleucina (Ile), leucine (Leu), lysine (Lys), fenilalanina (Phe), triptofano (Trp), e tirosina (Tyr).
  3. Categoria III. Sono amminoacidi che vengono convertiti in metaboliti intermedi del ciclo del TCA: metionina (Met) e valina (Val), convertiti in succinil-CoA; istidina (His), glutamine (Gln), acido glutammico (Glu), e prolina (Pro), convertiti in alpha-chetoglutarato; asparagina (Asn) e aspartato (Asp), convertiti in fumarato o oxaloacetato.

Nello schema in figura 1 si indica Glx la somma Gln+Glu e Asx la somma Asn+Asp. Le stesse categorie e i metaboliti verso cui convergono sono riassunti nello schema in figura 2. Questo tipo di schematizzazione è semplificata, infatti gli amminoacidi sono coinvolti in numerosi altri percorsi metabolici. Per esempio il triptofano, in presenza di fenomeni infiammatori, può essere degradato in acido quinolonico e acido chinurenico (Mehraj, V et Routy JP 2015), piuttosto che essere catabolizzato in acetil-CoA. Ma le semplificazioni sono molto utili in un sistema così complesso, come il metabolismo. I risultati di questa analisi sono riportati in figura 2. Come si vede:

  • non ci sono differenze significative tra i pazienti e il controllo, negli amminoacidi della categoria I (quelli convertiti in piruvato), con eccezione della alanina;
  • gli amminoacidi della categoria II sono ridotti nelle donne, ma normali negli uomini, con la eccezione della tirosina, ridotta anche nei maschi;
  • gli amminoacidi della categoria III sono ridotti nelle donne, ma normali nei maschi.

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Figura 2. Le tre categorie di amminoacidi, classificati in base al metabolita del metabolismo energetico in cui si convertono. Tabella di Paolo Maccallini.

Le donne sono diverse

Come si vede, si ha una significativa riduzione degli amminoacidi della categoria II e III nelle donne con ME/CFS, ma non nei maschi. Poiché gli amminoacidi della categoria II convergono nella sintesi di acetil-CoA e quelli della categoria III sono utilizzati per alimentare il ciclo del TCA a vari livelli, gli autori hanno dedotto che il ciclo del TCA non è adeguatamente alimentato dalla glicolisi e – per compensare – utilizza gli amminoacidi delle categorie II e III. Se si osserva la figura 1, il lettore può ipotizzare da solo che vi sia un qualche difetto nell’enzima piruvato deidrogenasi (PDH), il quale trasforma il piruvato in acetil-CoA. E questa è proprio l’ipotesi proposta da Fluge, Mella e il loro gruppo:

  • nelle donne con ME/CFS un blocco dell’enzima PDH non permette alla glicolisi di rifornire di Acetil-CoA il ciclo del TCA, così vengono bruciati amminoacidi della categoria II e III come forma di compenso.

Atrofia muscolare

In cerca di spiegazioni per la mancanza di alterazioni nel profilo metabolico dei maschi, gli Autori hanno misurato il livello sierico della 3-metilistidina  (3-MHis), una molecola che si eleva quando – in mancanza di cibo – gli esseri umani cominciano a nutrirsi dei propri stessi tessuti, ovvero catabolizzano i propri muscoli, utilizzandoli come fonte di proteine. Nelle donne il livello di 3-MHis è normale, ma nei maschi è significativamente elevato. Questo dato, e considerazioni che vedremo nel seguito, hanno portato gli Autori a ipotizzare che:

  • nei maschi con ME/CFS si ha lo stesso blocco dell’enzima PDH ipotizzato nelle donne, e le proteine contenute nei loro muscoli vengono disassemblate e utilizzate per alimentare il ciclo del TCA.

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Figura 3. Gli amminoacidi delle categorie I, II e III, con i loro punti di ingresso nel metabolismo energetico. I valori di alcuni metaboliti intermedi del ciclo del TCA sono ridotti nella ME/CFS. L’enzima aconitasi (aconitase, in inglese) è sovra espresso. Da (Fluge O et al. 2016) e (Yamano E, et al. 2016), con modifiche.

Norvegia vs Giappone

Cosa succederebbe allora se si misurassero direttamente i metaboliti del ciclo del TCA, come il citrato, l’alfa-chetoglutarrato etc? Cosa si aspetterebbe il lettore? La logica vorrebbe che questi metaboliti siano tutti ridotti, infatti se l’organismo si vede costretto a consumare amminoacidi al posto del glucosio, significa che il ciclo del TCA è inadeguatamente alimentato. Purtroppo lo studio norvegese non prevede la misura dei metaboliti del ciclo del TCA, ma qualcuno forse ricorderà che quei metaboliti sono stati misurati in un studio giapponese (Yamano E, et al. 2016). Avevo discusso quello studio in un mio precedente articolo. Nella figura 3 ho aggiunto i risultati dello studio giapponese allo schema proposto da Fluge e Mella. Come potete vedere i metaboliti del ciclo del TCA sono ridotti, e la riduzione è particolarmente significativa nel caso del citrato, dell’isocitrato e del malato. In definitiva, lo studio di Fluge e Mella è in accordo con quello di Yamano e complessivamente possiamo affermare che:

  • c’è un blocco del rifornimento di Acetil-CoA nei mitocondri da parte della glicolisi, quindi i mitocondri cercano di alimentarsi con amminoacidi (Fluge Ö et al. 2016), ma nonostante questo tentativo, la produzione energetica dei mitocondri resta deficitaria (Yamano E, et al. 2016).

Norvegia, Giappone e la reumatologia di Pisa

In un mio precedente articolo (vedi qui) ho discusso i risultati di uno studio europeo che ha visto la collaborazione di ricercatori italiani, inglesi e tedeschi, e di 45 pazienti ME/CFS della reumatologia di Pisa (Ciregia F et al 2016). Gli Autori hanno dimostrato – in questi pazienti – la sovraespressione di due enzimi mitocondriali: la subunità beta dell’enzima ATP sintetasi (ATPB) e la aconitasi mitocondriale (ACON). Il secondo enzima in particolare catalizza un passaggio metabolico del ciclo del TCA, la reazione che dal citrato porta al cis-acotinato. Ho riportato la posizione di questo enzima nella figura 3, in azzurro. Quello che ci interessa qui osservare è che lo studio sulla espressione dell’ACON è in perfetta sintonia con quello norvegese, infatti:

  • una riduzione della alimentazione del ciclo del TCA comporterebbe una sovraespressione di vari enzimi che catalizzano le reazioni del ciclo, allo scopo di estrarre ogni goccia di energia possibile dal substrato disponibile.

Anche la sovraespressione di ATPB – che è un enzima chiave della catena respiratoria – è coerente con questo modello e lo conferma ulteriormente.

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Figura 4. I metaboliti intermedi del ciclo del TCA di Whitney Dafoe sono tutti ridotti a un mezzo del normale.

 E il paziente zero?

In un mio articolo sul metabolismo energetico di Whitney Dafoe (il ‘paziente zero’) (vedi qui) avevo discusso come i metaboliti intermedi del suo ciclo del TCA fossero tutti ridotti a circa la metà dl valore medio normale (vedi figura 4). Non sarebbe neanche necessario osservare, a questo punto, che questo profilo metabolico è coerente con lo studio giapponese, con quello norvegese e con i dati provenienti dai pazienti della reumatologia di Pisa.

Lo studio Naviaux

In accordo con il presente studio, anche Naviaux e colleghi hanno riportato una riduzione di leucina, isoleucina e valina, tanto nei maschi che nelle femmine con ME/CFS (Naviaux R et al. 2016).

Conclusione

Lo studio norvegese suggerisce che la glicolisi non rifornisca di acetil-coA il ciclo del TCA in modo adeguato, per questo i mitocondri bruciano amminoacidi al posto del glucosio (catabolisi degli amminoacidi). Nelle donne gli amminoacidi sono sottratti al flusso sanguigno, nei maschi sono prelevati dai muscoli. Lo studio norvegese è in accordo con un precedente studio giapponese e con i dati del metabolismo di Whitney Dafoe, che riportano una complessiva riduzione dei metaboliti intermedi del ciclo del TCA. Anche la sovraespressione dell’enzima ACON, dimostrata nei pazienti della reumatologia di Pisa, è coerente con una alimentazione inadeguata del ciclo del TCA.

Dove fare gli esami?

Gli esami metabolici possibili al momento sono di due tipi: il profilo degli amminoacidi (come nello studio norvegese) oppure l’analisi diretta dei metaboliti intermedi del ciclo del TCA (come nello studio giapponese, e come nell’esempio di Whitney Dafoe). Ecco alcune indicazioni.

  1. Il profilo amminoacidico utilizzato da Fluge e Mella (figura 2) è disponibile in molti ospedali italiani (Bambin Gesù di Roma, Ospedale di Udine, Policlinico Umbero I di Roma etc), e può essere eseguito sia sul sangue (come nel caso dello studio norvegese) che su urine. L’esame sul sangue probabilmente fornisce una istantanea del metabolismo energetico medio di ogni cellula del corpo. L’esame delle urine può fornire altri dati, ma al momento non ho idee chiare sul loro significato. Questo esame sembra particolarmente indicato nelle donne, nei maschi potrebbe essere normale.
  2. Per quanto riguarda invece gli esami di metaboliti intermedi del ciclo del TCA, al momento non mi risulta siano disponibili negli ospedali italiani, ma sono offerti da questo laboratorio spagnolo, e probabilmente da altri laboratori europei di cui non sono a conoscenza. Per ulteriori informazioni rimando a questo mio articolo. Questo esame dovrebbe essere significativo tanto per le donne che per gli uomini.

La parola a Fluge e Mella

In questo video della televisione norvegese – con sottotitoli in inglese – gli autori dello studio commentano i loro risultati. Olav Mella – in particolare – sottolinea verso la fine del servizio che loro ritengono che la disfunzione alla base della ME/CFS sia reversibile.

Il prezzo dell’energia

Il prezzo dell’energia

Introduzione

Diversi lavori hanno fin qui dimostrato, nei soggetti ME/CFS, un insolito utilizzo dei sistemi anaerobici di produzione dell’energia. Discuterò questo argomento citando alcuni studi e portando come esempio, per fissare le idee, le misure effettuate sul mio stesso metabolismo energetico. Proporrò infine un possibile modello teorico per la post-exertional malaise.

Neutrofili in apnea

Nel 2009 e nel 2012 Myhill e colleghi pubblicarono i risultati di alcune misurazioni del metabolismo energetico dei neutrofili estratti dal sangue periferico di complessivi 200 pazienti ME/CFS. Tra le varie osservazioni fatte, di particolare interesse è il riscontro di un gruppo di pazienti, denominato dagli autori gruppo B, in cui la frazione di energia prodotta anaerobicamente risultava particolarmente elevata rispetto al controllo sano (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012). Io sono risultato appartenere a questo gruppo, infatti i miei neutrofili contano per il 23% sulla sintesi anaerobica di energia, quando normalmente questa quota non dovebbe superare l’11%. Questa iperproduzione anaerobica sembra un tentativo di compenso per la scarsa produzione aerobica di energia, che appare tuttavia velleitario. Infatti nel mio caso, e nel caso di tutti gli altri pazienti studiati da Myhill e colleghi, la sintesi di ATP era deficitaria. E’ importante notare che l’iperattività del sistema energetico anaerobico, rilevato nei neutrofili da Myhill, è stata recentemente confermata nelle cellule mononucleari (linfociti e monociti) del sangue periferico di pazienti ME/CFS, da un gruppo di ricercatori della Stanford University e della Columbia University (Lawson N et al. 2016). Il dato dunque si estende ad altre cellule, ed acquista un valore più universale.

Hai voluto la bicicletta?

Diversi studi hanno valutato le prestazioni fisiche dei pazienti ME/CFS durante il test ergospirometrico. In questo test il paziente viene posto su una cyclette e invitato a pedalare contro una resistenza crescente. Una mascherina collegata con dei tubi a dei sensori, misura lo scambio di ossigeno e anidride carbonica del soggetto con l’esterno, mentre degli elettrodi rilevano la sua attività cardiaca. Senza entrare nei dettagli, questi esperimenti hanno dimostrato che per erogare la stessa potenza, i pazienti ME/CFS utilizzano meno ossigeno dei controlli sani, ovvero fanno maggiore affidamento sui sistemi anaerobici di produzione della energia. Questo fenomeno si acutizza se il test viene ripetuto in due giorni consecutivi (Vanness, 2007), (Snell, 2013). Nel mio caso il volume di ossigeno consumato per Watt erogato al test ergospirometrico è minore di 9 ml/W, e questo depone appunto per un sistema aerobico inefficiente e per un sistema anaerobico iperattivo. E’ bene notare che, mentre le misure sui neutrofili dimostrano un problema del sistema aerobico solo in un tipo di cellula (il neutrofilo appunto), il test ergospirometrico conferma questo difetto a livello sistemico.

Dove si trova il guasto?

Uno scenario possibile nella ME/CFS è che il sistema aerobico di produzione di energia delle cellule sia difettoso, e che i sistemi anaerobici (sono almeno tre, vedi seguito) siano iperattivi, come tentativo di compenso. Ma dove si trova il difetto del sistema aerobico? Varie ipotesi sono possibili. Qui vorrei discuterne una che è stata proposta durante la conferenza IACFS/ME 2016, tenutasi in Florida in Ottobre. Il gruppo norvegese avrebbe proposto in quella sede un modello teorico in cui un qualche difetto al livello dell’enzima piruvato deidrogenasi (che trasforma il piruvato in acetil-CoA) impedisce il collegamento tra la glicolisi e il ciclo di Krebs. Questa ipotesi è particolarmente affascinante perché si sposa egregiamente sia con il lavoro di W. Armstrong sul catabolismo degli ammino acidi (Armstrong W et al. 2015) che con quello di Yamano sulla depressione della parte iniziale del ciclo di Krebs (Yamano E et al. 2016). Nel mio caso, senza entrare nei dettagli, ho verificato un consumo di diversi amminoacidi non essenziali, coerente con quello descritto da Armstrong. Questo significa che nelle mie cellule probabilmente si sta cercando di ossidare gli aminoacidi al posto dell’acetil-CoA, che forse non viene approvigionato per un problema al livello del piruvato deidrogenasi, in accordo con la teoria norvegese.

Il prezzo dell’energia anaerobica

Abbiamo visto sin qui che le mie cellule cercano di compensare un difetto del sistema aerobico di energia, potenziando il sistema anaerobico, oltre che tentando di ossidare gli amminoacidi. Ma quali sono i sistemi anaerobici di produzione di energia? Sono almeno tre, e li riassumo nel seguto.

  1. La glicolisi è il più conosciuto, e produce 2 molecole di ATP per ogni molecola di glucosio. Il prezzo da pagare per questo tipo di produzione di energia è la sintesi di lattato, una molecola tossica che il metabolismo deve prendersi l’onere di smaltire.
  2. L’idrolisi della fosfocreatina, con la quale viene liberato un fosfato inorganico per ogni molecola di fosfocreatina (Livingstone C et al. 2001).  La conseguenza di un uso eccessivo di questo percorso metabolico sarebbe la riduzione della creatina plasmatica, secondo Armstrong (Armstrong W et al. 2015), anche se non mi è chiaro il perché.
  3. La fusione di due molecole di ADP, con la formazione di una molecola di ATP e una di AMP, attraverso l’enzima adenilate chinasi. L’AMP è ulteriormente degradato in IMP e ammonio (NH3) (Livingstone C et al. 2001) e l’IMP viene ancora smembrato, producendo adenosina (Salway JG 2004).

Questi tre sistemi sono poco efficienti (sono sistemi primitivi, soppiantati dalla invenzione evolutiva dei mitocondri) e un loro utilizzo eccessivo, come visto, impone un prezzo metabolico da pagare. Usando il mio metabolismo come esempio, emergerebbe un uso eccessivo dei sistemi 2 e 3. Infatti non è mai risultato nel mio caso, se non in un paio di misurazioni, un accumulo eccessivo di lattato. Risulta invece una deplezione della creatina plasmatica (sistema 2) e un leggero accumolo di ammonia (sistema 3).

Adenosina e crash

Abbiamo visto che il mio ciclo di Krebs sembra non ricevere adeguato approvigionamento di acetil-CoA, e per compensare ossida amminoacidi. Abbiamo anche visto un altro tentativo di compenso, attraverso il sovrautilizzo di due sistemi anaerobici di produzione di energia, la idrolisi della fosfocreatina e la fusione di due ADP per formare una molecola di ATP. Questo secondo meccanismo in particolare, comporta la sintesi di ammonio, che è neurotossico, e di adenosina. L’adenosina è una molecola che presenta diversi recettori in vari tessuti. Se in particolare stimola il recettore A2a, la conseguenza è vasodilatazione (calo pressorio) (McVey MJ et al. 1999) e depressione del sistema dopaminergico nel sistema nervoso centrale (Schiffmann SN et al. 2007).

Ipotesi

Nel mio caso, il minimo sforzo fisico, a volte anche solo il fatto di restare seduto per alcune ore, causa un episodio di acutizzazione dei sintomi, che può durare da un giorno ad alcune settimane. Questi episodi sono caratterizzati da ipotensione ortostatica e letargia, con profonda confusione. Se ammettiamo che il mio metabolismo faccia affidamento in modo particolarmente elevato al terzo meccanismo di sintesi anaerobica della energia descritto più sopra, allora potrebbe aversi una produzione anomala di adenosina. Questa sostanza potrebbe causare vasodilatazione e depressione della trasmissione dopaminergica, e quindi costituire la base fisiologica di miei crash. Bisogna tuttavia menzionare il fatto che nello studio metabolomico di Robert Naviaux l’adenosina è stata misurata, e mentre nei maschi non è risultata alterata, nelle femmine è addirittura più bassa del normale (non più alta) (Naviaux R et al. 2016). Quindi al momento non esistono dati sperimentali a sostegno di questa ipotesi. Resta tuttavia plausibile, per me e per altri pazienti, lo scenario in cui un ciclo di Krebs ipoattivo (forse perché le sue vie di rifornimento sono bloccate) porta a un aumento della sintesi anaerobica di energia con uno o più dei sistemi anaerobici indicati. Ciascuno di essi è poco efficiente e richiede un prezzo metabolico da pagare.

Approfondimenti

  • Studio di Myhill e colleghi sui mitocontri dei neutrofili (qui).
  • Studio di Yamano e colleghi sul ciclo di Krebs (qui).
  • Studio metabolico di un paziente (qui).

Mitocondri inglesi, il test ‘ATP profile’

Mitocondri inglesi, il test ‘ATP profile’

Introduzione

Il lavoro di Naviaux e colleghi della University of San Diego sull’ipometabolismo nella ME/CFS, ha fornito dati convincenti a favore di una riduzione del metabolismo energetico in questa patologia (Naviaux R et al. 2016). Una interpretazione analoga è stata suggerita sulla base di un diverso set di dati da uno studio precedente (Armstrong CW et al. 2015) e da uno successivo (Yamano E, et al. 2016), mentre arrivano conferme ufficiose di questa ipotesi da Olav Mella (Universitetet i Bergen, Norvegia) e da Maureen Hanson (Cornell University, USA). Infatti sia i norvegesi che la Cornell University hanno riferito di studi (non ancora pubblicati) che confermano l’ipometabolismo.

A volte ritornano, l’epopea dei neutrofili

In questo contesto mi sembra allora utile riesumare una serie di tre studi pubblicati tra il 2009 e il 2013 da un gruppo inglese costituito dal fisico Norman Booth, dal medico Sarah Myhill, e da McLaren-Howard (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012), (Myhill S et al. 2013). In questi lavori gli autori dimostrarono una complessiva depressione del metabolismo energetico dei neutrofili estratti dal sangue periferico di 71 pazienti con diagnosi di ME/CFS (criteri Fukuda) e presentarono un test, denominato ‘ATP profile’, in grado non solo di separare completamente i soggetti malati dai 53 controlli sani, ma anche di predire il livello di disabilità dei pazienti, espresso in termini di scala di Bell, un indice numerico sviluppato dal dr. David Bell. Gli esperimenti di Myhill e colleghi non sono stati mai replicati da un altro gruppo, e inoltre riguardano solo i neutrofili. Tuttavia oggi sappiamo, come detto, che tutte le cellule del corpo presentano un difetto energetico nella ME/CFS. Quindi sembra possibile che ciò che trovarono nei neutrofili sia un dato reale ed estendibile a tutte le cellule del corpo. Pertanto descrivo in quanto segue il test ‘ATP profile’ (che consta della misura di diversi parametri) e i risultati degli studi di Myhill e colleghi, alla luce delle nuove scoperte.

Il test ‘ATP profile’

Il test si basa sulla misura dell’ATP sia all’interno dei neutrofili che all’interno dei mitocondri dei neutrofili, in diverse condizioni sperimentali. I neutrofili furono estratti dal sangue periferico di 71 pazienti e 53 controlli sani nel primo esperimento (Myhill S et al. 2009). In un secondo lavoro, la misurazione fu effettuata su un secondo gruppo di 138 pazienti (cohort 2) mentre i dati del primo esperimento furono riesaminati, dopo aver escluso 10 pazienti con età non compresa tra i 18 e i 65 anni, ottenendo così un campione di 61 persone (cohort 1) (Booth, N et al 2012). La misura del contenuto di ATP si basa su una metodica sviluppata nell’immediato dopoguerra (McElroy WD, 1947). In quello che segue descrivo il test, così come è presentato nello studio del 2009, e discuto i risultati di un soggetto che si è sottoposto all’esame.

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Figura 1. La catena respiratoria (Cohen BH, Gold DR. 2001).

Contenuto di ATP nei neutrofili. Viene misurata la concentrazione di ATP in presenza di eccesso di magnesio (ATP^Mg_1) e viene espressa in nano moli per milione di neutrofili (Myhill S et al. 2009). Nel caso che portiamo come esempio si ha:

ATP^Mg_1 = 1.38 nmol/(10^6 cell.)          [1.6-2.9]

Oltre a questa misura di ATP, se ne effettua una seconda, senza aggiunta di magnesio. La indichiamo ATP e nel nostro esempio vale:

ATP = 0.84 nmol/(10^6 cell.)              [0.9-2.7]

Gli autori calcolano poi il rapporto tra la seconda e la prima misura (Myhill S et al. 2009). Nel nostro paziente abbiamo:

ATP/ATP^Mg_1 = 0.53              [>0.65]

Gli Autori rilevano che il controllo sano presenta un valore medio di questo rapporto di 0.686 con una deviazione standardi di 0.032, e suggeriscono che il basso valore di questo rapporto nei pazienti sia indice di una carenza di Mg intracellulare. Questa carenza ha conseguenze fisiologiche importanti poiché il Mg è un elemento essenziale affinché l’enzima ATPase svolga la sua funzione, che è quella di ricavare energia dalla degradazione di ATP in ADP  (Booth, N et al 2012).

Glicolisi. Si inibisce la catena respiratoria utilizzando azoturo di sodio, il quale blocca sia l’enzima ATP sintetasi (complesso V in figura 1) che il citocromo a3 (complesso IV in figura 1). A questo punto viene meno la respirazione e i neutrofili consumano rapidamente lle riserve di ATP. Dopo alcuni minuti viene misurato il contenuto di ATP dei neutrofili (Myhill S et al. 2009). Detto ATP^Mg_2 questo valore, nel nostro esempio si ha:

ATP^Mg_2 = 0.32 nmol/(10^6 cell.)          [<o.3]

Gli Autori osservano che nei neutrofili dei soggetti sani l’inibizione dlla catena respiratoria porta a un rapido crollo dell’ATP a un valore pari al 7.5% del valore iniziale, con una deviazione standard di 3.4%. Questo sembra coerente con la possibilità che il metabolismo dei neutrofili sotto l’effetto dell’azoturo di sodio sia sostenuto solo dalla glicolisi (Booth, N et al 2012). In effetti la glicolisi produce due molecole di ATP per molecola di glucosio, mentre il ciclo di Krebs accoppiato alla respirazione ne produce 36, di cui 2 in condizioni anaerobiche. Dunque con inibzione della respirazione si avrebbe una riduzione teorica della sintesi di ATP a 4/34, ovvero 12% circa di quanto prodotto in condizioni aerobiche. Quindi il parametro:

ATP_ini = (ATP^Mg_2/ATP^Mg_1)

si può considerare una misura del contributo della sintesi anaerobica di energia. Nel caso del nostro paziente si ha:

ATP_ini = 0.232            [0.04-0.11]

Come riferimento, in questo caso, ho usato la media più o meno una deviazione standard, piuttosto che i valori forniti nel referto.

Respirazione. L’azoturo di sodio viene rimosso e si misura nuovamente il contenuto di ATP nei neutrofili, dopo un intervallo di tempo assegnato (3 minuti). Questa misura fornisce il valore ATP^Mg_3 e gli Autori riportano che a inibizione rimossa, il livello di ATP nei neutrofili del controllo sano aumenta a un 60-90% del valore iniziale ATP^Mg_1. A questo punto introducono il rapporto:

OxPhos = (ATP^Mg_3-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1-ATP^Mg_2)

che propongono come una misura della efficienza della respirazione (Myhill S et al. 2009), (Booth, N et al 2012). Nel nostro esempio si ha:

ATP^Mg_2 = 0.32 nmol/(10^6 cell.)          [<o.3]

ATP^Mg_3 = 0.87 nmol/(10^6 cell.)          [>1.4]

Si ottiene allora:

    OxPhos = (ATP^Mg_3-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1-ATP^Mg_2) = 0.519        [>60]

Purtroppo, a mio parere, OxPhos è piuttosto una misura della capacità della catena di trasporto degli elettroni di riprendersi dalla inibizione con azoturo di sodio, quindi una generica misura della salute della catena di trasporto. Come misura del contributo della ossidazione alla produzione di energia propongo invece il parametro:

ATP_oss = ( ATP^Mg_1-ATP^Mg_2)/(ATP^Mg_1) = 1 – ATP_ini

Nel nostro caso si ha

ATP_oss = 0.768            [0.89-0.96]

Come riferimento, in questo caso, ho usato la media più o meno una deviazione standard, piuttosto che i valori forniti nel referto.

translocase.png
Figura 2. ADP/ATP translocasi (Bos taurus), da Protein Dat Bank, ID 10KC, con modifiche. In blu la superficie dlla membrana interna del mitocondrio (che si affaccia sulla matrice), in rosso la superficie che si affaccia sullo spazio compreso tra membrana mitocondriale interna e membrana mitocondriale esterna.

ADP/ATP translocasi. Questo enzima (riportato come ANT in figura 1) permette l’ingresso dell’ADP all’interno della matrice mitocondriale, dove viene convertito in ATP dall’enzima ATP sintetasi (complesso V in figura 1). ANT si estende tra la superficie esterna e la superficie interna della membrana interna dei mitocondri (figura 2). Presenta quattro isoforme negli esseri umani (ADT1, ADT2, ADT3, ADT4) probabilmente tessuto-specifiche. Il trasferimento di ADP e ATP è molto dispendioso e richiede il 25% della energia prodotta dalla respirazione (Kilngerberg M, 2008). Se l’enzima ANT non funziona correttamente, ne risulta una inibizione della catena di trasporto degli elettroni, del piruvato deifrogenasi (che converte il piruvato in Acetil-CoA), e di tutto il ciclo di Krebs (Pieczenik SR, Neustadt J, 2006).

Misura della efficienza di ADP/ATP translocasi. Durante l’esecuzione dell’ATP profile alcuni mitocondri vengono estratti dai neutrofili e il loro contenuto di ATP viene misurato. Detto ATPmito_1 questo valore, nel caso del nostro soggetto si ha:

ATPmito_1 = 225 pmol/(10^6 cell.)          [290-700]

dove ‘cell’ non si riferisce più ai neutrofili, ma ai mitocondri. Inoltre in questo caso la misura è in pico moli, cioè 10^(-12) moli. A questo punto un secondo campione di mitocondri è immerso in un bagno di ADP in modo da indurre l’enzima ANT a far entrare ADP nei mitocondri. Segue una nuova misura dell’ATP mitocondriale, che indichiamo ATPmito_2. Nel nostro esempio si è misurato il seguente valore:

ATPmito_2 = 290 pmol/(10^6 cell.)          [410-950]

Ci si aspetta un aumento di ATP perché l’ADP è uno degli ingredienti fondamentali per la sua sintesi. Nel nostro soggetto l’aumento è minimo, e questo viene interpretato dagli Autori come una scarsa capacità dell’enzima ANT di far entrare ADP nel mitocondrio. A questo punto il pH di una terza coltura di mtocondri è modificato (portato a 8.9 ± 0.2) in maniera da favorire la fuoriuscita di ATP dai mitocondri, sempre attraverso l’enzima ANT. Il contenuto di ATP dei mitocondri è quindi nuovamente misurato, fornendo il parametro ATPmito_3, che nel nostro soggetto è:

ATPmito_3 = 194 pmol/(10^6 cell.)          [140-330]

Da queste misure gli autori ricavano i seguenti due quozienti:

TL_out = (ATPmito_2-ATPmito_1)/ATPmito_1

TL_in = (ATPmito_3-ATPmito_1)/ATPmito_1

Il primo valore è proposto come una misura della efficienza di ANT nel traslocare ADP dal citoplasma a dentro i mitocondri; il secondo rapporto fornirebbe invece una misura della efficienza dello stesso enzima nel traslocare ATP dai mitocondri, dove è prodotto, al citoplasma (Myhill S et al. 2009).  Nel caso portato come esempio si ha

TL_out = 0.289        [>0.35]

TL_in = 0.138        [55-75]

Mitochondrial energy score. Gli autori hanno proposto un indice che riassume l’efficienza del sistema energetico dei mitocondri, chiamato Mitochondrial Energy Score (MES). Questo indice è stato definito in modo diverso nello studio del 2009 e in quello del 2012. Noi ci rifaremo alla definizione proposta nel primo studio, perché per quella del 2012 non vengono fornite tutte le indicazioni necessarie per effettuare il calcolo. La definizione è:

mes

dove 0,182 è il più basso valore che il prodotto a numeratore raggiunge nel controllo sano. Per il nostro paziente si ha:

MES = 0,0151/0,182 = 0,083

Gli autori associarono a ciascuno dei 71 pazienti il relativo indice MES e l’indice di Bell, riportando poi per ciascuno di essi un punto in un piano avente come ascissa l’indice di Bell e come ordinata il MES (vedi figura 3). Calcolarono poi la retta di regressione dei dati, la quale fornisce una funzione che permette di predire l’inidice di Bell, noto che sia il MES. Questa funzione si ricava facilmente dal grafico in figura 3 ed è data da:

Indice di Bell = 1 + 7,5MES

Per il nostro paziente restituisce un indice di Bell di 1.6, quindi diciamo 2. Questo corrisponde a 20 nella scala di Bell (che è dieci volte il valore di quello che abbiamo chiamato qui indice di Bell). Riporto la descrizione dei valori 20-30 della scala di Bell:

  • 20. Sintomi da severi a moderati a riposo. Incapace di svolgere attività impegnative. Incapace di lasciare casa, se non raramente. Confinato a letto per la maggior parte del tempo. Incapace di concentrarsi per più di un’ora al giorno. Funzionalità complessiva al 30-50% del normale.
  • 30. Sintomi da severi a moderati a riposo. Sintomi severi dopo qualunque tipo di esercizio. Generalmente confinato a casa. Incapace di svolgere qualunque attività impegnativa. Capace di svolgere lavoro al tavol per 2-3 ore al giorno, con bisogno di periodi di riposo. Funzionalità complessiva al 50%.

Il soggetto in effetti si colloca esattamente a questo livello di funzionamento, e questa è stata la qualità della sua vita per la maggior parte della sua annosa malattia, con brevi oscillazioni verso livelli maggiori di funzionamento. Si osservi che la funzionalità complessiva riportata nella scala di Bell è un indice che vuole tener conto anche delle funzioni organiche più semplici, come respirare e digerire; non è misura della produttività del soggetto.

mes-2
Per ciascun paziente si riporta un punto sul piano che ha in ascissa l’indice di Bell (che è dato dal valre sulla scala di Bell, diviso 10) e il MES in ordinate. E’ evidenziata in rosso la retta di regressione e i punto che individuano i tre pazienti portati come esempio (Myhill S et al, 2009). Sono evidenziati in rosso i punti relativi ai tre pazienti discussi in questo testo.

Le due ME/CFS

Booth e colleghi notarono che i pazienti della coorte 2 si distinguevano in due gruppo ben diversi fra loro. In un gruppo ricadevano pazienti con una attività glicolitica elevata (ATP_ini basso) e nell’altro coloro con una valore normale di questo parametro. Fu possibile inoltre notare che il primo gruppo presentava una ridotta funzione di trasporto dell’ATP fuori dai mitocondri (LT_in basso), mentre il secondo gruppo presentava un LT_in più alto del normale. Entrambi i gruppi presentano un basso trasporto di ADP dentro i mitocondri (vedi figura 4.A, 4.B, 4.C). In definitiva è possibile distinguere nella ME/CFS i seguenti due gruppi:

  • Gruppo HI Blk: individui con una respirazione particolarmente compromessa (ATP_oss basso), una compromisione del trasporto di ATP fuori dai mitocondri (TL_in basso) e di ADP dentro i mitocondri (TL_out basso);
  • Gruppo HI TL_in: individui con un normale equilibrio fra respirazione e glicolisi (ATP_oss normale), una iperattività del trasporto di ATP fuori dai mitocondri (TL_in alto) e una compromisione del trasporto di ADP dentro i mitocondri (TL_out basso).

Il paziente del nostro esempio appartiene al gruppo HI Blk, mentre gli altri due pazienti discussi nel seguito appartengono all’altro gruppo (vedi figura 4.A). Gli autori suggeriscono che la riduzione della respirazione nel gruppo HI Blk sia causata dal blocco di ANT nella funzione di trasporto di ATP fuori di mitocondri (Booth L et al. 2012). Nel gruppo HI Blk si potrebbe pensare che vi sia un blocco complessivo dell’enzima ANT, genetico o epigenetico. Nel gruppo HI TL_in invece abbiamo un’iperattività di questo enzima la quale potrebbe rappresentare un qualche meccanismo di compensazione. E’ bene ricordare che ANT si trova a cavallo della membrana interna del mitocondrio, e dunque attinge ADP dallo spazio fra membrana esterna e mebrana interna. Questo permette di formulare la seguente ipotesi:

  • Nel gruppo HI TL_in qualcosa nello spazio fra le due membrane del mitocondrio interferisce con l’interazione fra ADP e ANT. Questo porta a una sovra esepressione di questo enzima, come misura di compenso, che si manifesta come un aumento del trasporto di ATP fuori dalla matrice mitocondriale da parte di ANT stesso.
tl-in
Figura 4. Nella cohort 2 di distinguono due gruppi di pazienti ben differenziati. Uno, nominato Hi TL IN, presenta un valore più alto del normale di TL IN associato a un normale ATP_oss; l’altro, nominato Hi Blk, presenta un basso TL IN associato a un basso ATP_oss (Booth L et al. 2012). In figura sono riportate anche le coordinate dei tre pazienti esaminati. Il pz. 1 appartiene al gruppo Hi Blk, gli altri due al gruppo Hi TL IN.

L’origine del blocco

Gli Autori suggeriscono che l’umento di TL_in sia dovuto a una mancanza di substrato della catena respiratoria, ovvero ADP, fosfato inorganico, CoQ10, NADH, Mg. La mancanza di ADP potrebbe essere dovuta a sua volta al blocco di ANT nella sua funzione di trasporo di ADP dal citoplasma ai mitocondri, infatti l’89% del gruppo HI TL_in presenta un basso valore di TL_out (figura 4). Da notare che anche il gruppo HI Blk presenta in buona parte (78%) un basso LT_out (figura 4). Complessivamente tutti i pazienti della coorte 2 presentano almeno una delle due vie di trasporto bloccate. Questo induce gli autori a pensare che l’enzima ANT svolga un ruolo centrale nel determinare la disfunzione mitocondriale alla base della ME/CFS. Tra le possibili origine del blocco dell’enzima ANT gli Autori menzionano i seguenti fattori:

  • prodotti del metabolismo di virus o batteri;
  • sostanze di scarto prodotte da un danno ai tessuti;
  • sostanze chimiche di origine ambientale (Booth L et al. 2012).
mes-3
Figura 5. Sono riportati i dati del paziente usato come esempio (paziente 1), e di altri due pazienti (paziente 2 e paziente 3). In arancio sono riportati i valori sopra la norma, in azzurro quelli sotto la norma. Nella colonna a destra si riporta inoltre il significato di ciascuna misura. I parametri usati per il calcolo del MES (secondo lo studio del 2009) sono 1, 3, 8, 12, 13. Nello studio del 2012 il parametro 13 fu sostituito dal 6.

Tre pazienti

Riporto sinteticamente i dati del paziente che abbiamo discusso sopra (paziente uno) e di altri due pazienti (vedi figura 5). Discuto ora brevemente i tre casi.

Paziente 1. Si possono fare le seguenti osservazioni.

  • Complessivamente la sintesi di ATP è poco efficiente, come suggeriscono i valori ATP^Mg_1 e ATPmito_1, entrambi bassi.
  • Il rapporto tra ATP senza aggiunta di magnesio e ATP con aggiunta di Mg (valore 3 in figura 4) è basso, e questo suggerisce probabilmente una insufficienza di Mg intracellulare  (Booth, N et al 2012).
  • Esiste uno sbilancio fra la glicolisi e la respirazione (ATP_in alto) che probabilmente riflette un blocco della respirazione. Questo sembra giustificare il valore complessivamente basso dell’ATP intracellulare.
  • La catena respiratoria ha uno scarso recupero dallo stress chimico costituito dall’azoturo di sodio (OxPhos basso).
  • Si nota la capacità estremamente ridotta di ANT di traslocare ATP fuori dai mitocondri. Infatti si ha una riduzione relativa del 13,8% tra ATPmito_3 e ATPmito_1, dove normalmente si registra una riduzione fra 55 e 75%. Questo probabilemnte giustifica il fatto che la misura ATPmito_3 sia nella norma. Infatti dopo la rimozione del bagno di ADP, l’ATP fatica a uscire dal mitocondrio e rimane all’interno.
  • Anche il trasporto di ADP dentro i mitocondri è inibito (LT_out basso) e quindi si può dire che complessivamente l’enziam ANT è poco funzionale.
  • Carenza di magnesio intracellulare, bassa attività di respirazione, elevata sensibilità della catena respiratoria a stress chimici, e blocco dell’enzima ANT sono in accordo con un MES di solo 0.083, che si traduce in un 20 della scala di Bell, ovvero una condizione di ME/CFS severa.
  • Scala di Bell: 20. Sintomi da severi a moderati a riposo. Incapace di svolgere attività impegnative. Incapace di lasciare casa, se non raramente. Confinato a letto per la maggior parte del tempo. Incapace di concentrarsi per più di un’ora al giorno. Funzionalità complessiva al 30-50% del normale.

Paziente 2.  Si possono fare le seguenti osservazioni.

  • Complessivamente la sintesi di ATP è poco efficiente, come suggeriscono i valori ATP^Mg_1 e ATPmito_1, entrambi bassi.
  • Il rapporto tra ATP senza aggiunta di magnesio e ATP con aggiunta di Mg (valore 3 in figura 4) è basso, e questo suggerisce probabilmente una insufficienza di Mg intracellulare  (Booth, N et al 2012).
  • I valori ATP_ini e ATP_oss sono normali, a indicare un buon equilibrio tra glicolisi e respirazione.
  • La catena respiratoria ha uno scarso recupero dallo stress chimico costituito dall’azoturo di sodio (OxPhos basso).
  • Spiccata la capacità di ANT di traslocare ATP fuori dai mitocondri. Infatti si ha una riduzione relativa del 77,5% tra ATPmito_3 e ATPmito_1, dove normalmente si registra una riduzione fra 55 e 75%. Questo alto valore di TL_in contribuisce a migliorare il MES del paziente. E’ plausibile pensare che questa sovra attivazione dell’enzima ANT sia una forma di compensazione per la inadeguata capacità del soggetto di sintetizzare ATP (ATP^Mg_1 e ATPmito_1 bassi).
  • Il trasporto di ADP dentro i mitocondri è inibito (LT_out basso) e forse contribuisce al difetto di ATP intracellulare del soggetto.
  • Carenza di magnesio intracellulare, elevata sensibilità della catena respiratoria a stress chimici, e blocco dell’enzima ANT nel trasporto di ADP dentro i mitocondri, contribuiscono a determinare un MES di 0.57, che si traduce in un 50 della scala di Bell, ovvero una condizione di ME/CFS moderata.
  • Scala di Bell: 50. Sintomi moderati a riposo. Sintomi da severi a moderati dopo esercizio o attività. Incapace di svolgere mansioni impegnative, ma può svolgere lavori leggeri o lavoro al tavolo per 4-5 ore al giorno, avendo però bisogno di periodi di riposo. Funzionalità complessiva al 70% del normale.

Paziente 3.  Non ci sono sostanziali differenze con il profilo del paziente 2.

Confronto con altri studi

In una recente pubblicazione italo-tedesca su due gemelli omozigoti, uno dei quali con ME/CFS (l’atro sano), l’enzima ADP/ATP translocasi risulta sotto espresso nel fratello malato, rispetto al fratello sano (Ciregia F et al 2016). Questa ridotta espressione potrebbe essere la causa del complessivo scarso funzionamento dell’enzima nel gruppo HI Blk, oppure potrebbe essere una misura di compenso per il funzionamento eccessivo della traslocazione di ATP fuori dai mitocondri rilevata nel gruppo HI TL_in. Difficile fare ipotesi, ma questa coincidenza è interessante.

Due recenti studi metabolomici hanno apparentemente individuato quelli che sembrano essere due diversi tipi di ME/CFS. In uno è stata descritta una anomalia metabolica caratterizzata da lattato elevato e da un difetto nel ciclo di Krebs (Yamano E, et al. 2016); in un altro invece si è riportato un difetto della glicolisi, con ridotto piruvato e lattato (Armstrong CW et al. 2015). Si potrebbe speculare che i pazienti descritti da Yamano appartengano al gruppo HI Blk, mentre quelli descritti da Armstrong siano del tipo HI LT_in.

Test ergospirometrici eseguiti due giorni di seguito sui pazienti ME/CFS, hanno dimostrato nella prova del secondo giorno che la soglia anaerobica entra precocemente e in definitiva i pazienti consumano meno ossigeno per erogare un watt, rispetto a un soggetto normale (anche sedentario) (Vanness, 2007), (Snell, 2013). Quindi i pazienti farebbero maggiore affidamento sul sistema anaerobico per produrre energia, esattamente come il gruppo HI Blk.

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