Neuropatia delle piccole fibre

Neuropatia delle piccole fibre

Introduzione

Le piccole fibre sono tratti del sistema nervoso periferico per lo più sprovvisti di guaina mielinica (fibre C). Innervano la pelle (fibre somatiche coinvolte nella percezione del dolore), gli organi interni, e sono anche coinvolte nella funzione del sistema nervoso autonomo (fibre autonomiche) (Devigili G et al. 2008).

Le piccole fibre del sistema nervoso autonomo sono tratti post-ganglionici tanto del ramo simpatico che del ramo parasimpatico. Le prime si dividono in piccole fibre simpatiche sudmotorie (coinvolte nella sudorazione e sono a trasmissione colinergica) e in piccole fibre simpatiche cardiache (regolano la frequenza e la pressione cardiaca e sono a trasmissione adrenergica); le seconde regolano la frequenza cardiaca e sono a trasmissione colinergica (Goodman BP 2007).

Test diagnostici

Il danno alle piccole fibre simpatiche sudomotorie si rileva con il quantitative sudomotor axon reflex test (QSART) che misura la fuoriuscita di sudore nei seguenti siti: avambraccio, fascia laterale prossimale della gamba, parte interna della gamba, piede (Goodman BP 2007).  Questo test è anormale in pazienti ME/CFS+POTS e in pazienti POTS non CFS (Okamoto LE et al. 2012).

Un altro modo di rilevare un danno alle piccole fibre è quello di misurare la loro densità nella pelle. A questo scopo si esegue una biopsia cutanea della profondità di 3 mm in due sedi: 10 cm sopra il malleolo e 10 cm sopra il ginocchio, e si esaminano le piccole fibre al microscopio. Si ottiene in questo modo la densità delle fibre nervose intra-epidermiche (IENFD): un valore <7/mm indica un danno (Goodman BP 2007). Non sono sicuro, ma credo che questo test misuri sopratutto danni alle fibre somatiche.

Test in Italia

La biopsia cutanea per la misura della densità delle piccole fibre si esegue presso la UOC III Clinica Neurologica IRCCS, Istituto Besta di Milano (dr. Giuseppe Lauria Pinter).

La biopsia cutanea e i test di sudorazione vengono effettuati presso la Fondazione Salvatore Maugeri a Telese Terme (BN).

Neuropatia delle piccole fibre, POTS e ME/CFS

Un danno alle piccole fibre si riscontra in svariate patologie, tra cui diabete, Sjogren, ipotiroidismo, malattia celiaca e altre (Devigili G et al. 2008). Nella POTS si ha una prevalenza di neuropatia delle piccole fibre significativamente magguiore che nelle persone sane. In uno studio del 2013 il 37% dei pazienti POTS (9/24) presentava una biopsia cutanea anormale, contro lo 0% dei controlli sani (Gibbons CH et al. 2013).  Non esistono studi sulla prevalenza della neuropatia delle piccole fibre nella ME/CFS, ma la sovrapponibilità tra ME/CFS e POTS (Okamoto LE et al. 2012) nonché casi aneddotici (R) suggeriscono che un sottogruppo di pazienti ME/CFS possa essere portatore di questa malattia. Nella ME/CFS e nella POTS si può pensare che la neuropatia delle piccole fibre sia – almeno in parte e almeno in alcuni casi – la causa dei sintomi, più che una mera conseguenza (come succede invece nel diabete).

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Esami in Italia per ME/CFS, Lyme e POTS

Esami in Italia per ME/CFS, Lyme e POTS

In questa pagina troverete un elenco (in ordine alfabetico) di esami non comuni – eseguiti da ospedali pubblici – che sono di interesse per pazienti affetti da ME/CFS e Lyme e – più in generale – per chiunque stia seguendo un percorso di diagnosi differenziale per identificare la causa di sintomi quali fatica e deficit cognitivi. Per ogni esame è presente una breve descrizione, con riferimenti alla letteratura scientifica o ad articoli di questo blog. Questo elenco è stato costruito grazie al contributo di Margarita Bitetti, Claudia Mariotti, Marina Franco e altri pazienti. Chiunque volesse suggerirmi una aggiunta, mi scriva pure. Cerco esami eseguiti da ospedali pubblici italiani o europei. Non includo esami eseguiti da laboratori privati. Si nota anche che alcuni di questi esami potrebbero non essere più disponibili o essere stati cambiati dal momento in cui ho ricevuto l’informazione.


Babesia. La babesiosi umana è causata da protozoi del genere Babesia che vivono negli eritrociti. In Europa la babesiosi è trasmessa principalmente da Ixodes ricinus, la stessa zecca che trasmette la malattia di Lyme. E’ teoricamente possibile la trasmissione attraverso trasfusioni. Secondo alcuni studi la contemporanea trasmissione di Babesia e Borrelia rende peggiore e più lungo il decorso della malattia di Lyme. I sintomi della babesioisi sono sintomi influenzali, mialgie, disturbi gastro-intestinali  (Stinco G. et Bergamo S. 2016). Le principali specie patogene in Europa sono Babesia divergens, B. venatorum, B. microti (ECDC). I test per Babesia possono essere eseguiti nei centri indicati qui di seguito.

  • Esame diretto presso il Policlinico San Matteo, Pavia. Si tratta dell’esame al microscopio dello “striscio” di sangue. Questo test permette la diagnosi nella fase acuta della infezione.
  • Ricerca del DNA presso l’Ospedale Sacro Cuore Don Calabria, Verona. Purtroppo questo esame è disponibile solo per la specie B. microti. Non è nota la cross-reattività per le altre specie europee, ma non è da escludere.
  • Sierologia presso l’Azienda Ospedaliera di Padova. La sierologia viene eseguita solo per la specie B. microti. Non è nota la cross-reattività per le altre specie europee, ma non è da escludere.

Borrelia burgdorferi. Si tratta dell’agente eziologico della Malattia di Lyme. Molti articoli del blog sono dedicati a questa patologia e l’elenco completo – dal più recente al più vecchio – può essere trovato qui. Ogni grande ospedale dovrebbe avere a disposizione un test sierologico per la malattia di Lyme, ovvero un test ELISA di primo livello e un western blot di conferma. Nel seguito segnalo alcuni test particolari.

  • Western blot presso l’Ospedale di Bolzano. Questo esame rileva IgM e IgG contro le seguenti proteine di superficie: P100, VlsE, p58, p41, p39, OspA, OspC (B. burgdorferi ss, B. afzelii, B. garinii, B. spielmanii), p18 (B. burgdorferi ss, B. afzelii, B. garinii, B. spielmanii, B. bavarensis).
  • Western blot presso l’Ospedale San Daniele del Friuli. Questo esame rileva le IgM contro: VlsE, p41, BmpA (p39), OspC (B. burgdorferi ss, B. afzelii, B. garinii). Rileva le IgG contro: VlsE (B. burgdorferi ss, B. afzelii, B. garinii), lipidi (B. burgdorferi ss, B. afzelii), p83, p41, BmpA (p39) OspC, p58, p21, p20, p19, p18.
  • Ricerca del DNA presso l’Ospedale Maggiore di Trieste. Questo esame rileva la presenza di un frammento del gene che codifica per la flagellina di Borrelia (Pauluzzi P, Bonin S et al. 2004). Una positività al test indica con buona probabilità una infezione attiva.
  • LTT Elispot presso la Struttura Complessa Microbiologia e Virologia dell’Ospedale Le Molinette di Torino. I test LTT in generale, e il test Elispot in particolare, misurano l’attività delle cellule T del paziente (ricavate da un prelievo di sangue) contro particolari agenti patogeni. Una introduzione agli studi su questo tipo di esame nella malattia di Lyme si trova in questo articolo del blog. Questi test non sono raccomandati dalle linee guida europee sulla malattia di Lyme e sono da ritenersi sperimentali. In particolare, esiste un rischio di falsi positivi e falsi negativi. Il rischio di falsi positivi sembra ancora più elevato in base alle recenti ricerche sul funzionamento delle cellule T, secondo le quali una cellula T generata contro un patogeno X può in realtà riconoscere numerosi altri patogeni. Le cellule T sarebbero cioè intrinsecamente plurivalenti e non specifiche, per ovviare alla scarsa varietà di cellule T che un essere umano può generare (Birnbaum ME et al. 2014). Su questo stesso argomento segnalo anche un altro articolo del blog.

Coxiella burnetii. Questo batterio intracellulare è l’agente eziologico delle Febbre Q, una zoonosi comune in Europa. Si trasmette prevalentemente per inalazione di particelle contaminate, attraverso consumo di latte non pastorizzato (Ledina D. et al. 2007). La febbre Q è diffusa anche in Italia, da Nord a Sud (Fenga C et al. 2015). Si ipotizza anche una trasmissione attraverso morso di Ixodes ricinus – lo stesso vettore della malattia di Lyme – ma ad oggi questa via di tasmissione non è stata dimostrata (Eldin C et al. 2017). Uno studio ha rilevato la presenza di C. burnetii nel 7% degli esemplari di Ixodes ricinus raccolti in un parco di Roma (Mancini F et al. 2014), si veda in proposito questo articolo del blog. In alcuni casi di Febbre Q, la malattia non si risolve, dando luogo a una condizione cronica denominata post-Q-fever fatigue syndrome (post-QFS), simile alla ME/CFS e ad alcuni casi di “Lyme cronica” (Ayers JG et al. 1998), (Hickie I et al. 2006), (Ledina D. et al. 2007). La cosa interessante è che degli studi indicano che alcuni di questi pazienti presentano una infezione persistente e possono trarre giovamento da cure specifiche per C. burnetii  (Arashima, Y et al. 2004), (Ledina D. et al. 2007). Lo stesso José Montoya (Stanford University) ha riportato casi aneddotici di miglioramento, grazie all’uso della doxiciclina (video, da 35:40). La questione resta comunque controversa.

  • Sierologia e ricerca del DNA per Coxiella burnetii presso l’Ospedale Lazzaro Spallanzani di Roma. Questi esami misurano rispettivamente la presenza di IgM/IgG e la presenza di DNA del batterio nel sangue periferico.

Citochine. Un recente studio della Columbia University ha misurato 51 citochine in 298 pazienti ME/CFS e in 348 controlli sani (sangue periferico), riportando un incremento significative di alcune di esse nei pazienti in cui la malattia durava da meno di 3 anni, e una riduzione significativa in tutti gli altri (Hornig M et al. 2015). Inoltre diversi studi hanno riportato un aumento del trasforming growth facor beta totale (TGF-β) (Bennett AL et al. 1997), (Peterson D et al. 1994), (Chao CC et al. 1991), (Montoya J et al. 2017) e del TGF-β 1 nei pazienti ME/CFS (White PD et al. 2004), (Kennedy G et al. 2004). Per approfondimenti rimando a questo articolo del blog.

  • Pannello delle citochine presso l’Azienda Ospedaliera di Padova. E’ possibile misurare il livello ematico delle seguenti citochine: interferone alfa, interleuchina 1 alfa, interleuchina 1 beta, interleuchina 2, interleuchina 4, interleuchina 6, interleuchina 8, TNF alfa, TGF-β 1.

Citotossicità spontanea delle Natural Killer. Una ridotta capacità delle NK di uccidere cellule invase da virus è stata dimostrata in più studi sulla ME/CFS. In particolare, ben 16 studi hanno dimostrato una ridotta citotossicità delle NK quando le cellule K562 siano usate come bersaglio (IOM, 2015). Uno dei primi articoli è quello di Caligiuri e colleghi del 1987  (Caligiuri et al., 1987). In seguito si poté chiarire che questa citotossicità difettosa risulta legata a una ridotta concentrazione intracellulare (nelle NK) di perforina (Maher et al., 2005), l’enzima che tanto le NK che le T CD8+ usano per indurre l’apopotosi delle cellule infette. Recentemente la disfunzione delle NK nella ME/CFS è stata collegata a un malfunzionamento dei canali di calcio transient receptor potential melastatin 3 (TRPM3) (Nguyen T et al. 2016). Si osserva comunque che la riduzione della citotossicità delle NK non è specifica della ME/CFS e si riscontra anche in altre patologie, come il lupus eritematoso sistemico e la sindrome di Sjögren (Struyf NG et al. 1990).

  • Misura della citotossicità spontanea delle NK presso il Policlinico Umberto I di Roma, UOC di Immunologia e Immunopatologia. In questo esame si msura la capacità delle NK (estratte dal sangue periferico del paziente) di uccidere cellule K562, in corrispondenza di 4 diluizioni diverse.

Ergospirometria in due giorni. Questo test si avvale dell’uso di una bicicletta fissa o di un tapis roulant su cui il paziente si esercita, mentre vengono misurati l’ossigeno e l’anidride carbonica che scambia con l’esterno (attraverso la bocca) e i parametri cardiaci. Lo scopo del test è principalmente quello di avere una misura della efficienza del sistema di produzione della energia del soggetto. Nei pazienti ME/CFS è stato possibile dimostrare che sebbene questo test dia risultati comparabili a quelli di persone sane sedentarie, se si ripete il test a distanza di 24 ore, si riscontra un difetto nel sistema aerobico di produzione della energia. In particolare, i pazienti usano meno ossigeno del normale per unità di potenza erogata (Vanness JM et al. 2007), (Vermullen RCW et al. 2010), (Snell CR et al. 2013). In alcuni casi il test viene anormale fin dal primo giorno. Questo test ha valore legale.

  • Ergospirometria in due giorni presso il Complesso Integrato Columbus, Policlinico Gemelli di Roma. Il test viene effettuato in due giorni consecutivi. Contattare il dr. Pistelli per la prenotazione.

Neuropatia delle piccole fibre. Le piccole fibre sono tratti del sistema nervoso periferico per lo più sprovvisti di guaina mielinica (fibre C). Innervano la pelle (fibre somatiche coinvolte nella percezione del dolore), gli organi, e sono anche coinvolte nella funzione del sistema nervoso autonomo (fibre autonomiche) (Devigili G et al. 2008).

Le piccole fibre del sistema nervoso autonomo sono tratti post-ganglionici tanto del ramo simpatico che del ramo parasimpatico. Le prime si dividono in piccole fibre simpatiche sudmotorie (coinvolte nella sudorazione e sono a trasmissione colinergica) e in piccole fibre simpatiche cardiache (regolano la frequenza e la pressione cardiaca e sono a trasmissione adrenergica); le seconde regolano la frequenza cardiaca e sono a trasmissione colinergica (Goodman BP 2007).

Il danno alle piccole fibre simpatiche sudomotorie si rileva con il quantitative sudomotor axon reflex test (QSART) che misura la fuoriuscita di sudore nei seguenti siti: avambraccio, fascia laterale prossimale della gamba, parte interna della gamba, piede (Goodman BP 2007).  Questo test è anormale in pazienti ME/CFS+POTS e in pazienti POTS non CFS (Okamoto LE et al. 2012).

Un altro modo di rilevare un danno alle piccole fibre è quello di misurare la loro densità nella pelle. A questo scopo si esegue una biopsia cutanea della profondità di 3 mm in due sedi: 10 cm sopra il malleolo e 10 cm sopra il ginocchio, e si esaminano le piccole fibre al microscopio. Si ottiene in questo modo la densità delle fibre nervose intra-epidermiche (IENFD): un valore <7/mm indica un danno (Goodman BP 2007). Non sono sicuro, ma credo che questo test misuri sopratutto danni alle fibre somatiche.

Un danno alle piccole fibre si riscontra in svariate patologie, tra cui diabete, Sjogren, ipotiroidismo, malattia celiaca e altre (Devigili G et al. 2008). Nella POTS si ha una prevalenza di neuropatia delle piccole fibre significativamente magguiore che nelle persone sane. In uno studio del 2013 il 37% dei pazienti POTS (9/24) presentava una biopsia cutanea anormale, contro lo 0% dei controlli sani (Gibbons CH et al. 2013).  Non esistono studi sulla prevalenza della neuropatia delle piccole fibre nella ME/CFS, ma la sovrapponibilità tra ME/CFS e POTS (Okamoto LE et al. 2012) nonché casi aneddotici (R) suggeriscono che un sottogruppo di pazienti ME/CFS possa essere portatore di questa malattia. Nella ME/CFS e nella POTS si può pensare che la neuropatia delle piccole fibre sia – almeno in parte e almeno in alcuni casi – la causa dei sintomi, più che una mera conseguenza (come succede invece nel diabete).

  • La biopsia cutanea per la misura della densità delle piccole fibre si esegue presso la UOC III Clinica Neurologica IRCCS, Istituto Besta di Milano (dr. Giuseppe Lauria Pinter).
  • La biopsia cutanea e i test di sudorazione vengono effettuati presso la Fondazione Salvatore Maugeri a Telese Terme (BN).

Risonanza magnetica spettroscopica. Un aumento del lattato nei ventricoli laterali nel cervello dei pazienti ME/CFS è stato riportato in almeno 2 studi (Mathew SJ et al. 2009), (Murrough JW et al. 2010). Il lattato è, insieme al piruvato, il prodotto finale della glicolisi (vedi questo post) e un suo aumento può indicare un difetto del sistema aerobico (mitocondri). E’ possibile misurare il lattato, e molte altre molecole, leggendo e interpretando il campo magnetico indotto sul tessuto cerebrale da un campo magnetico esterno. L’apparecchio che svolge questa funzione è la risonanza magnetica spettroscopica (una introduzione a questa tecnologia si trova qui oppure in questo mio articolo).

  • RM encefalo con spettroscopia presso la Neuroradiologia del Policlinico Umberto I di Roma. In genere la RM spettroscopica del cervello analizza un volume (64 cm^3) della materia bianca al di sopra dei ventricoli laterali. Se si viene sottoposti a questo esame si tenga presente che l’anomalia del lattato nella ME/CFS  NON è stata riscontrata in quella sede anatomica, ma nel fluido contenuto nei ventricoli laterali. Quindi è necessario richiedere esplicitamente che vengano esaminati i ventricoli laterali.

Tilt table test (TTT). La intolleranza ortostatica fa parte dei criteri diagnostici della ME/CFS (IOM, 2015). Esistono due tipi principali di intolleranza orostatica: la ipotensione ortostatica (OH) e la tachicardia posturale (POTS). Entrambe queste patologie possono essere diagnosticate monitorando polso e pressione mentre il paziente è su una tavola basculante che da posizione orizzontale viene portata a una posizione verticale (tilt table test, TTT) (Low PA et al. 2009). Esiste in paricolare una sovrapposizione fra POTS e ME/CFS, infatti la prevalenza della POTS nella ME/CFS varia dal 19 al 70% (a seconda degli studi) mentre la prevalenza della ME/CFS nella POTS varia dal 17 al 23% (Okamoto LE et al. 2012). I pazienti ME/CFS con POTS presentano varie anomalie, tra cui un aumento della noradrenalina in ortostatismo. La noradrenalina e la adrenalina vengono in genere misurate durante il TTT, sia nella posizione di partenza (clinostatismo) che nella posizione finale (ortostatismo).


 

 

 

 

OMF: Pubblicati i resoconti del Simposio Collettivo – Notiziario di agosto

OMF: Pubblicati i resoconti del Simposio Collettivo – Notiziario di agosto

Cari amici italiani.

Siamo molto grati ed entusiasti di poter condividere le notizie della Open Medicine Foundation (OMF) con la vostra associazione. Vi invitiamo a condividere queste informazioni con la vostra organizzazione e su Facebook o Twitter. Se desideri ricevere il testo e le immagini in altri formati (Word, PDF), mandami una richiesta a sara@omf.ngo. Questo messaggio è stato cortesemente tradotto da Paolo Maccallini.

Uniti nella speranza, Sara

Sito web:

https://www.omf.ngo/2017/08/30/omf-newsletter-august-2017/

https://d1qwuymb7uy402.cloudfront.net/wp-content/uploads/2017/09/Italian-August-2017-Newsletter-Website.pdf

Antibodies to adrenergic and muscarinic receptors in ME/CFS

Antibodies to adrenergic and muscarinic receptors in ME/CFS

Latest news

During the Community Symposium on the molecular basis of ME/CFS (R) two different groups of researchers reported on an increased level of antibodies to beta adrenergic and muscarinic receptors in sera from ME/CFS patients vs healthy controls (Figure 1). These new data have been collected independently by Alan Light (University of Utah) and Jonas Bergquist (Uppsala Universitet). Bergquist also reported that these autoantibodies can’t be found in cerebrospinal fluid from ME/CFS patients.

autoantibodies
Figure 1. Two slides from the symposium: on the left data from Uppsala Universitet, on the right data from a group of patients studied by Alan Light (University of Utah).

What was already known on these autoantibodies

The presence of a higher than normal reactivity of sera from ME/CFS patients to muscarinic receptors was reported for the first time by a Japanese group, more than a decade ago (Tanaka S et al. 2003) and it has been confirmed recently in a work by University of Bergen (Norway) and Charité University (Germany) (Loebel M et al. 2016). In particular, while Tanaka and colleagues measured an increased level of autoantibodies against muscarinic cholinergic receptor 1 (CHRM1) in about half of patients, the other group described an increase in reactivity of sera to subtypes M3 and M4, in a subset of patients (Figure 2). They used two completely different assays, as we will see later, and this might be the reason for the different results.

autoantibodies 2
Figure 2. An increase in reactivity of sera from ME/CFS patients to M1 cholinergic receptors was reported by Tanaka and colleagues in 2003 (left). Loebel and colleagues found an increase in reactivity to M3, M4 cholinergic receptors and beta 2 adrenergic receptors in 2016 (right).

As you can see from figure 2, the study by Loebel et al. also indicated an increase in antibodies to beta adrenergic receptors (subtype 2), in agreement with the latest data from Light and Bergquist. In this regard, it is worth noting that autoantibodies to muscarinic receptors M2 and M3, and to beta adrenergic receptors (subtype 1 and 2) have been already reported in orthostatic hypotension (OH) (Yu X et al. 2012), (Li H et al. 2012) and that antibodies to beta 2 adrenergic receptors have been identified in patients with postural-orthostatic tachycardia syndrome (POTS) (Li et al. 2014). This means that this group of autoantibodies is associated with orthostatic intolerance (POTS and/or OH), but orthostatic intollerance is part of the clinical picture of ME/CFS (IOM 2015) and those patients who have a diagnosis of POTS often have many features in common with ME/CFS patients, see for instance (Okamoto L et al. 2012), (Wise S et al. 2015). So, it might be conceivable that these autoantibodies play a role in the pathogenesis of some symptoms in a subgroup of patients, although this has not been proven, so far.

Molecular mimicry?

We don’t know the reason why the immune system of some ME/CFS patients reacts with these receptors, but Alan Light suggested, during the symposium, that a possible source for these antibodies might be a mechanism known with the name of molecular mimicry (MM). The basic idea behind MM is that B cells can erroneously produce antibodies to human proteins when epitopes of an infectious agent closely resemble epitopes found in the host (Rose NR 1998). MM is currently believed to explain the pathogenesis of Guillain-Barré syndrome, where lipo-oligosaccharides on the Campylobacter jejunii outer membrane seems to elicit (in predisposed individuals) an immune response to human gangliosides, due to the similarity between these antigens (Van den Berg B et al. 2014). Now, if molecular mimicry was involved in the origin of antibodies to beta 2 adrenergic receptors, which could be the epitope on the receptor? And which the pathogen-borne antigen? In order to provide a possible answer to this question we have to consider that the regions of a receptor that can be involved in B cell autoimmunity are only those that have extracellular exposure; the other regions are immersed in plasma membrane and in cytoplasm, so they can’t interact with antibodies. As you can see from Figure 3, beta 2 adrenergic receptor (ADRB2) has four extracellular regions, in particular peptides 1-34, 96-106, 175-196, 299-305. In general, epitopes are mainly conformational and that means that they are regions of the protein surface, produced by the folding of the protein itself. Nevertheless, in our example we will search only for linear epitopes.

Beta 2
Figure 3. Schematic representation of ADRB2, from (Rasmussen G et al. 2007). You can notice the extracellular peptides 1-34 (the N-terminus), 96-106 (loop 1), 175-196 (loop 2), 299-305 (loop 3).

I have used QuickBLASTP provided by NCBI, with default settings (E=100, a word of 6 letters, BLOSUM62 as substitution matrix) and I have considered for each of the four extracellular peptides both the sequence of residues from the N-terminus to the C-terminus, and the inverted sequence. We obtain as the only match the protein sensor histidine kinase MtrB belonging to Pseudonocardia sp. Ae331_Ps2 (R) (Figure 4). I can’t find this particular protein in UniProt, but if it was a membrane protein and if peptide 67-77 was exposed to the extracellular space, this peptide could perhaps be a candidate as a trigger for anti-ADRB2, according to the MM theory. It is important to note here that although molecular mimicry is a popular theory (perhaps because of its simplicity) it has been proven to be a cause of autoimmnity only in Guillain-Barré syndrome.

molecular mimicry
Figure 4. Peptide 2-12 of the ADRB2 receptor resembles peptide 67-77 of sensor histidine kinase MtrB (from Pseudonocardia sp. Ae331_Ps2).

So, what about a test for these autoantibodies?

If antibodies to adrenergic and muscarinc receptors were involved in the pathogenesis of some cases of ME/CFS, it would be interesting for patients to test for them. In this regard, it is worth noting that the measure of antibodies to membrane receptors should be done using an assay in which these receptors are expressed by living cells in their physiological position (CBA, cell based assay). In fact, with assays in which receptors are coated on plates we may have both false positives (due to the fact that sera react with peptides that are not in the extracellular domain) and false negatives (due to protein denaturation, which leads to the formation of epitopes that would not be present if the protein were correctly folded). The superiority of CBA over the other kind of test is well accepted in the case of anti-MOG antibodies (Ramanathan S et al 2016). It is worth noting that the study by Loebel et al. used a CBA, while the previous one (Tanaka et al.) used recombinat proteins coated on plates, and this could be the reason for the discrepancy between the results of the two studies (figure 2). As far as I know, there are no commercial CBA assays for anti-muscarinic cholinergic receptors and beta adrenergic receptors, at present. The only assay available does not seem to be a CBA, from the provided documentation (R).

ADRB2_2R4R_231_242
Figure 5. I have reported in yellow the epitope predicted by DiscoTope 2.0 on the 3D structure of ADRB2 (PDB ID: 2R4R chain A). I have also indicated what part of the molecule is outside the cell, what is inside the membrane and what is inside the cell.

In silico experiment

We will now try to simulate what could happen with a test for the search of anti-ADB2R antibodies, if the protein was coated on a plate. We will use the prediction of DiscoTope 2.0, which is a software that calculates all possible B cell epitopes of a given protein, using both the geometry of the protein (in particular a parameter called protrusion index, calculated from the protein’s ellipsoid of inertia) and statistical data on known B cell epitopes (Kringelum, et al., 2012). If we use the 3D structure of ADB2R experimentally determined in (Rasmussen et al. 2007) with standard settings, DiscoTope predicts peptide 231-242 as the only possible epitope (consider that the experimental 3D structure of ADB2R is incomplete). As you can see from figure 5 this peptide belongs to the intracellular domain of the receptor and so it by no means could be a B cell epitope, in vivo. In conclusion, according to this simulation, there is a risk of false positive results with any test that uses recombinat ADB2R coated on a plate.

 

Simposio sulla ME/CFS a Stanford, autoanticorpi

Simposio sulla ME/CFS a Stanford, autoanticorpi

1. Introduzione

In quello che segue riporto alcune note prese durante il simposio sulla ME/CFS tenutosi a Stanford questo 12 agosto, organizzato dalla Open Medicine Foundation. Tutti gli interventi sono disponibili su youtube (R). In questo primo post parlerò esclusivamente di autoanticorpi e auspicabilmente ne seguiranno altri su altri argomenti.

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Figura 1. Sia l’università di Uppsala (sinistra) che la universita dello Utah (destra) confermano la presenza di anticorpi contro i recettori beta adrenergici e contro i recettori muscarinici della acetilcolina.

2. Anticorpi contro i recettori beta adrenergici e muscarinici della acetilcolina

In questo simposio si è avuta una conferma della presenza di anticorpi contro i recettori beta adrenergici e contro i recettori muscarinici della acetilcolina in modo significatimante maggiore nei pazienti ME/CFS, rispetto ai controlli sani (Figura 1). I dati provengono da due gruppi di ricerca distinti, quello di Alan Light (University of Utah) e quello di Jonas Bergquist (Uppsala Universitet). Il riscontro nella ME/CFS di anticorpi contro i recettori muscarinici della acetilcolina fu inizialmente riportato da un gruppo giapponese (Tanaka S et al. 2003) e recentemente da un gruppo norvegese-tedesco (Loebel M etal. 2016), il quale ha anche rilevato – per la prima volta – la presenza di anticorpi contro il recettore beta 2 adrenergico. In particolare, lo studio giapponese trovò un aumento negli anticorpi contro il recettore muscarinico M1 della acetilcolina, mentre quelo successivo evidenziò un aumento negli anticorpi contro i recettori M3 e M4 della acetilcolina (Figura 2). Vale la pena osservare che anticorpi contro i recettori adrenergici beta 1 e 2 e muscarinici M2 e M3 sono stati riscontrati anche nella ipotensione ortostatica (Yu X et al. 2012), (Li H et al. 2012), mentre gli anti-recettore adrenergico beta 2 sono stati rinvenuti nel siero di pazienti con tachicardia posturale ortostatica (Li et al. 2014). Quindi questi stessi autoanticorpi ricorrono nella intolleranza ortostatica, e la intolleranza ortostatica è un sintomo inserito nei criteri diagnostici per la ME/CFS (IOM 2015). Tutto ciò, nel complesso, sembra conferire solidità a questo dato immunitario, e suggerisce che questi autoanticorpi possano avere un ruolo causale in almeno alcuni dei sintomi di un sottogruppo di pazienti. In particolare, alcuni di questi anticorpi hanno dimostrato di interferire con la regolazione fine del diametro dei vasi sanguigni (Li H et al. 2012) e per questo potrebbero teoricamente alterare il flusso di sangue nei muscoli scheletrici e/o nel cervello.

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Figura 2. A sinistra lo studio del 2003, dove si riportò un aumento degli anticorpi contro il recettore muscarinico M1 della acetilcolina nella ME/CFS. A destra lo studio del 2016 in cui si riporta un aumento degli anticorpi contro i recettori muscarinici M3 e M4 della acetilcolina e contro il recettore beta 2 della adrenalina nella ME/CFS.

Non è dato sapere contro quali particolari sottotipi di recettori siano stati trovati autoanticorpi nei due nuovi studi di Light e Bergquist. Tuttavia sappiamo che Bergquist si è premurato di cercarli non solo nel sangue periferico, ma anche nel liquido spinale, trovandoli solo nel primo (figura 1).

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Figura 3. Recettore beta 2 adrenergico. Si osserva l’esposizione extracellulare della coda 1-34, e dei loop 96-106, 175-196, 299-305.

3. Mimetismo molecolare

Non sappiamo perché si generino questi autoanticorpi, ma Light suggerisce che un possibile meccanismo sia rappresentato dal così detto mimetismo molecolare: il sistema immunitario produce un anticorpo contro una proteina di un patogeno – durante una infezione –  ma questa proteina assomiglia a una molecola umana e così – per errore – l’anticorpo si lega all’antigene umano, anche dopo che l’infezione è scomparsa. Questo meccanismo è ritenuto alla base della sindrome di Guillian-Barré a seguito di infezione da Campylobacter jejuni (Van den Berg B et al. 2014). Se consideriamo in particolare il recettore adrenergico beta 2, le regioni che possono essere bersaglio di anticorpi patogenetici sono quelle che dalla membrana cellulare si proiettano verso lo spazio extracellulare (figura 3), ovvero le quattro sequenze di amminoacidi 1-34, 96-106, 175-196, 299-305. Il lettore può verificare da solo, usando il software BLAST offerto dal National Centre for Biotecnology Information (R) che il peptide 2-12 del recettore è simile al peptide 67-77 della proteina sensor histidine kinase MtrB del batterio Pseudonocardia sp. Ae331_Ps2 (R) (figura 4). Questo potrebbe voler dire che – in linea del tutto teorica – un contatto del sistema immunitario con questo batterio potrebbe portare allo sviluppo di anticorpi contro il recettore adrenergico beta 2. Questo è solo un esempio che ho voluto mostrare, per far capire in pratica cosa si intenda per mimetismo molecolare.

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Figura 4. Inserendo come query sequence alternativamente i peptidi 1-34, 96-106, 175-196, 299-305 del recettore adrenergico beta 2 in BLAST di NCBI, usando l’algoritmo Quick BLASTP e impostazioni di default (E=100, word di 6 lettere, BLOSUM62 come matrice di sostituzione) si ottiene come unico risultato l’allineamento fra il peptide 2-12 del recettore umano e il peptide 67-77 della proteina sensor histidine kinase MtrB di Pseudonocardia sp. Ae331_Ps2.

4. Non tutti i test sono uguali

E’ importante notare che la misura di anticorpi contro proteine di mebrana (come i recettori) deve essere effettuata incubando il siero dei pazienti con proteine che siano espresse da cellule nella loro posizione fisiologica (cell based assay, CBA). Con l’altra tipologia di test, in cui la proteina è incollata a una piastra, si rischiano tanto falsi positivi (perché la proteina espone al siero regioni che normalmente sarebbero coperte) che falsi negativi (perché la proteina è denaturata e la sua conformazione 3D è alterata). Il vantaggio di un CBA sui test tradizionali è stato dimostrato chiaramente nel caso degli anticorpi anti-MOG (Ramanathan S et al 2016). Bisogna dire che mentre lo studio norvegese-tedesco ha usato la metodologia corretta, quello giapponese del 2003 usò l’altra metodologia e questo forse rende conto della discrepanza dei risultati (figura 2). Non sappiamo che tipo di test abbiano usato Light e Bergquist.

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Figura 5. Modello 3D parziale del recettore beta 2 adrenergico (PDB ID: 2R4R, chain A). E’ indicata la posizione relativa alla membrana plasmatica e il peptide 231-242 individuato come possibile epitopo da DiscoTope 2.0. Si vede come questo epitopo è completamente immerso nel citoplasma e quindi non raggiungibile da autoanticorpi in condizioni fisiologiche.

5. Esperimento in silico

Il software DiscoTope 2.0 permette di prevedere tutti i possibili di una proteina contro i quali vengono prodotti anticorpi (regioni dette epitopi). La predizione viene fatta sulla base sia delle caratteristiche geometriche della proteina, che di considerazioni statistiche sulla composizione e topologia degli epitopi noti fino ad oggi (Kringelum, et al., 2012). Se consideriamo in paricolare il recettore beta 2 adrenergico, utilizzando il modello 3D ottenuto sperimentalmente nel 2007 (Rasmussen et al. 2007) e lo sottoponiamo al software DiscoTope 2.0, si ottiene come unico possibile epitopo il peptide 231-241, il quale tuttavia si trova immerso nel citoplasma (figura 5) e quindi, in condizioni fisiologiche, non potrebbe mai costituire un bersaglio per anticorpi. Tuttavia, in un test di tipo ELISA in cui il recettore beta 2 adrenergico è incollato a una piastra e viene esposto al siero, si potrebbero verificare dei falsi positivi dovuti alla reazione del siero dei pazienti contro l’epitopo 231-241.

 

Bartonellosi

Bartonellosi

Introduzione

Una decina delle 21 specie di batteri appartenenti al genere Bartonella sono potenzialmente in grado di generare infezioni sintomatiche negli esseri umani, con manifestazioni che possono avere gravità variabile: da malattie che si risolvono spontaneamente a condizioni che mettono a repentaglio la vita del paziente. Anche la durata può variare, da infezioni acute di qualche giorno a infezioni croniche (Mogollon-Pasapera E et al. 2009).

Malattia da graffio del gatto e altre manifestazioni

La più nota di queste patologie è forse la “malattia da graffio del gatto” (cat-scratch diesease) dovuta a Bartonella henselae e trasmessa agli uomini dai gatti, attraverso morsi o graffi. La trasmissione da gatto a gatto avviene attraverso le pulci (Ctenocephalides felis) e il 50% dei gatti domestici è portatore sano di questo patogeno (Massei F et al. 2005). In genere la malattia da graffio del gatto si limita ad avere una manifestazione locale e si risolve da sola; in altri casi può avere manifestazioni sistemiche quali febbre, mal di testa, fatica, e perdita di appetito. Il trattamento – se richiesto – può andare da 5 giorni di azitromicina per le forme lievi, a una combinazione di doxiciclina (o eritromicina) e rifampicina per 1-2 mesi, per le forme neurologiche (Klotz SA et al. 2011). Una rassegna delle principali malattie umane associate a Bartonella, delle vie di trasmissione, e delle terapie antibiotiche raccomandate si trova in Tabella 1 (Mogollon-Pasapera E et al. 2009).  Come si vede, in funzione della specie di Bartonella coinvolta, le manifestazioni cliniche possono comprendere retiniti, endocarditi, angiomatosi (proliferazione vascolare), la malattia di Carrion (febbre, anemia, ittero), adenopatia, e la febbre quintana (trench fever, febbre alta con mialgie, mal di testa, fatica).

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Tabella 1. Malattie umane associate a varie specie di Bartonella, terapie e vie di trasmissione.

Bartonellosi o borreliosi?

Un recente studio francese ha delineto la possibilità che una malattia cronica caratterizzata da fatica e mialgia, con o senza mal di testa, sia dovuta a una infezione da Bartonella (soprattutto da B. henselae) e sia trasmessa da zecche (Vayssier-Taussat M et al. 2016). Lo studio ha considerato 66 persone che avevano riportato la comparsa di sintomi cronici a seguito di un morso di zecca; i pazienti erano accomunati dal fatto di essere sieronegativi per Borrelia burgdorferi. Il loro sangue è stato sottoposto a coltura per 45 giorni su terreno arricchito da sangue di pecora. Sei dei 66 campioni hanno visto la formazione di colonie batteriche ascrivibili al genere Bartonella: in tre casi si è potuto identificare materiale genetico di B. henselae, negli altri 3 di altre tre specie di Bartonella (Tabella 2). Lo stesso test condotto sul sangue di 70 donatori sani è risultato negativo in ogni campione. Questo studio suggerisce (ma non dimostra) che sintomi aspecifici come fatica e mialgia, a seguito di morso di zecca, possano essere dovuti a una infezione da Bartonella (in particolare B. henselae) piuttosto che essere espressione della malattia di Lyme. Anche Richard Horowitz ha segnalato la possibilità che pazienti con manifestazioni atipiche della malattia di Lyme siano portatori di una infezione da Bartonella, da trattare con cure specifiche (tetraciclina, idrossiclorochina e quinolonico) (Horowitz R, 2014). La presenza di Bartonella henselae nello stomaco di Ixodes ricinus (il vettore della malattia di Lyme in Europa) è stata recentemente riportata in Francia, Portogallo e Germania (Dietrich F et al 2010), ma non in Italia (Mancini F et al. 2014).

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Tabella 2. I sei pazienti francesi positivi per Bartonella e sieronegativi per Borrelia, con sintomi cronici a seguito di morso di zecca.

In accordo con lo studio francese e le osservazioni di Horowitz, recentemente un articolo proveniente dall’Open Medicine Institute ha segnalato un caso di malattia di Lyme (eritema migrante) refrattario ai trattamenti, caratterizzato da fatica, mal di testa e difficoltà a mantenere l’equilibrio, in cui una coltura su sangue ha evidenziato la presenza di Bartonella henselae. Un trattamento con rifampicina e claritromicina per 5 mesi ha risolto la sintomatologia. Gli autori dello studio hanno sottolineato come la sierologia del paziente per Bartonella fosse negativa, e solo la coltura cellulare di 21 giorni eseguita dal laboratorio Galaxy Diagnostics sia stata in grado di rilevare la infezione da B. henselae (Kauffman DL et al. 2017).

Conclusione

La bartonellosi potrebbe aggiungersi alle infezioni trasmesse dal morso di zecca, sebbene non si abbia ancora la certezza di questo. La malattia si manifesterebbe con sintomi aspecifici quali fatica, mialgie, mal di testa. Non risponderebbe alle cure normalmente utilizzate per Borrelia burgdorferi e quindi potrebbe rendere conto di almeno alcuni dei casi di ‘Lyme cronica’, ovvero di quella condizione refrattaria ai trattamenti, verso cui evolve il 10-20% dei casi di malattia di Lyme.

RituxME!

RituxME!

In questo collegamento la pagina della University of Bergen (Norvegia) dedicata al trial di fase III, multicentrico, randomizzato, in doppio cieco, con gruppo placebo, sull’uso del Rituximab nella ME/CFS.

Rituximab è un anticorpo monoclonale che permette di eliminare selettivamente la sottopopolazione CD20+ delle cellule B (figura 1). Le celleule B vergini presenti nel midollo non esprimono questa proteina (figura 2) (Dalakas MC 2008), e questo permette al sistema immunitario di ricostituirsi, dopo l’azione del farmaco. In tre studi precedenti dello stesso gruppo, Rituximab si è dimostrato efficace nel migliorare temporaneamente il quadro clinico in 2/3 dei pazienti (Fluge Ø et Mella O, 2009), (Fluge Ø et al. 2011), (Fluge Ø et al. 2015). Al netto dell’effetto placebo (o delle fluttuazioni spontanee) si potrebbe ipotizzare un effetto significativo in metà dei pazienti.

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Figura 1. Rituximab, come Ocrelizumab, è un autoanticorpo avebte come bersaglio un epitopo della proteina CD20, espressa sulla mebrana citoplasmatica di alcune cellule B.
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Figura 2. La vita di una cellula B, dalla nascita nel midollo osseo, pasando per la attivazione, la ipermutazione somatica e la formazione della memoria anticorpale. Disegno di Paolo Maccallini.

Lo studio coinvolge 152 pazienti ME/CFS che sono stati trattati e seguiti – negli ultimi due anni – in 5 centri ospedalieri distribuiti sul territorio norvegese (per questo lo studio è detto multicentrico). I pazienti sono stati divisi in modo casuale (randomizzato) fra coloro a cui viene somministrato il farmaco e coloro a cui è somministrato il placebo. Nessuno, né i pazienti né il personale sanitario, è a conoscenza di cosa venga somministrato al paziente (doppio cieco) e il placebo è una sostanza innocua che ha lo stesso esatto aspetto del farmaco. A settembre chiuderà la fase sperimentale e verranno ‘rotti i codici’, ovvero si potrà sapere chi ha ricevuto il farmaco. I dati verranno analizzati nei mesi successivi e si presume che la pubblicazione avrà luogo nel 2018. Come è già successo in passato nella comunità ME/CFS, si potrebbe immaginare che parte dei risultati sarà resa nota prima ancora della pubblicazione. Se lo studio confermasse quelli precedenti, dovremmo cominciare a pensare alla ME/CFS nei termini di una malattia delle cellule B, almeno in un sottogruppo di pazienti.

I fondi necessari per realizzare questo studio furono raccolti grazie alla iniziativa di una paziente, Maria Gjerpe, che ha raccontato i retroscena di quella avventura in un Ted Talk: