Severely ill big data study, a first glance

Severely ill big data study, a first glance

A first glance at the results of the “severely ill big data study” that was launched two years ago and that have been presented during the Community Symposium, held in August at Stanford (pics and contents are from this video and this other one).

There is an alteration in cortisol production, with a low level early in the morning and an higher than normal level as time passes by (figure 1).

20819208_10212561127239607_286693524324914716_o1-e1512989015270.jpg
Figure 1. There is a distruption in cortisol secretion in patients vs controls, with low cortisol early in the morning and a slight increase later on.

There is an increase in leptine and a decrease in brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (figure 2), an increase in lysine and a decrease in indolepropionate (which is involved in tryptophan metabolism) (figure 3).

20818900_10212561169240657_639960759344760665_o-e1512989057505.jpg
Figure 2. Leptin is increased while BDNF is decreased.
20776677_10212561284203531_3801233735178140551_o
Figure 3. Indolepropionate is significantly reduced while lysine is increased in patients vs controls.

In microbiota we see an increase in Firmicutes at the expense of Bacterioides, with a huge increase in Verrucomicrobia in two patients (figure 4).

20728801_10212561307084103_1868596309719464780_o-e1512989135810.jpg
Figure 4. There is an increase in Firmicutes and a decrease in Bacteriodes in patients vs healthy controls.

If we consider gene expression in ME/CFS and compare it with what we have in other diseases, we find a strong similarity with systemic inflammatory response syndrome, and with diseases caused by parasites, gram negative bacteria, trypanosoma, lentivirus. Enchondromatosis was another disease with similar gene expression (figure 5).

20819054_10212561315564315_5018893509325920693_o
Figure 5. Gene expression of ME/CFS compared to other diseases.
20728709_10212561362525489_2553184777059756306_o
Figure 6. Cell free DNA is normal in all ME/CFS patients enrolled in this study with the exception of two of them.

Cell free DNA, which is often high in diseases with tissue damage, is normal in patients (figure 6). DNA from several viruses has not been found in blood (figure 7).

20776631_10212561364725544_682927784255997997_o-e1512953828433.jpg
Figure 7. Several common viruses have been searched for in blood, wuth negative results.

Cytokines are high in patients vs control, and the worse the clinical picture the higher they are (figure 8).

20746378_10212561368005626_4552494947980509062_o
Figure 8. In this set of 63 cytokines, the worse the symptoms, the higher the cytokines in blood.
Annunci

CMRC conference 2017, altri interventi

CMRC conference 2017, altri interventi

Spettroscopia di Raman

In questo intervento di Karl Morten (Oxford University) viene discussa la applicazione della spettroscopia di Raman nella ME. In questa tecnica si esamina il cambiamento nella frequenza della emissione luminosa che attraversa delle molecole e si risale alla natura delle molecole stesse. In particolare, qui si discute l’applicazione di questo metodo allo studio dei metaboliti contenuti nei leucociti dei pazienti ME vs controlli sani. In figura 1 il contenuto di fenilalanina nei leucociti di 5 controlli sani (a sinistra) e in quelli di 5 pazienti (a destra). Si vede una tendenza a una riduzione nel livello di fenilalanina nei pazienti.

19060119_10212852978775713_8741632709749044003_n.jpg
Figura 1. Contenuto di fenilalanina nei leucociti di 3 controlli sani (a sinistra) e di 5 pazienti (a destra).

Ricordo che nello studio di Fluge e Mella sui metaboliti nel sangue periferico (spettroscopia di massa), la fenilalanina era fra i metaboliti ridotti nei pazienti di sesso femminile (vedi qui). Quindi si avrebbe un accordo fra ciò che è stato rilevato nel sangue e ciò che si trova dentro le cellule.

Ipoperfusione cerebrale in ortostatismo

Frans Visser ha presentato uno studio del flusso sanguigno cerebrale nei pazienti ME/CFS durante il tilt table test. L’apparato sperimentale è abbastanza semplice: il flusso sanguigno cerebrale è assunto proporzionale alla portata della arteria carotidea interna e della arteria vertebrale (collo); le portate si misurano con un ecografo (figura 2).

21557580_10212859523059316_1962570132817464624_n
Figura 2. Misura del flusso sanguigno cerebrale durante il tilt table test (TTT).

Durante l’ortostatismo si ha una fisiologica riduzione del flusso sanguigno cerebrale così misurato, ma nei pazienti la riduzione è significativamente più consistente (figura 3).

21558608_10212859538259696_7334297456721194540_n
Figura 3. Il flusso sanguigno cerebrale è ridotto nei pazienti vs i controlli durante il TTT.

Un aspetto innovativo di questo studio è che ci si è premurati di fare la stessa misura anche mettendo i pazienti seduti per mezzora. Anche in questo caso la riduzione del flusso sanguigno cerebrale è più consistente nei pazienti vs i controlli (figura 4).

21751698_10212859540099742_8764750334551625697_n
Figura 4. Il flusso sanguigno cerebrale è ridotto nei pazienti vs i controlli sani anche considerando la posizione da seduti.

 

Sembra una banalità, ma in tutti gli studi sulla intolleranza ortostatica che ho letto finora si usa il tilt table test, o lo standing test e quindi la posizione seduta non è contemplata. Un anno fa ebbi la curiosità di confrontare i miei parametri cardiaci dello standing test con quelli da seduto e ho trovato che mentre nello standing test si apprezza una classica POTS, nella posizione seduta (sitting test?) si rileva una ipotensione ortostatica (se si usano i parametri diagnostici classici della ipotensione ortostatica) dopo 20-30 minuti. Non so se questo risultato sia estendibile ad altri pazienti.

Tornando alla presentazione di Visser, la conclusione è che tanto in ortostatismo che da seduti, il 71% pazienti ha una anomala riduzione del flusso sanguigno cerebrale, se confrontati con i controlli sani (figura 5). E questo potrebbe giustificare il fatto che molti pazienti semplicemente non tollerano né la posizione seduta, né l’ortostatismo e sono costretti per la maggior parte del tempo in clinostatismo. Il sangue che arriva al cervello è inadeguato e questo letteralmente li costringe a stendersi.

21740441_10212859544139843_3997053678723632571_n
Figura 5. Il 71% dei pazienti presenta un ridotto flusso cerebrale in ortostatismo, rispetto ai controlli sani.

Una cosa interessante di questo studio è che i pazienti ME non erano stati selezionati in base alla presenza di classica intolleranza ortostatica (POTS o ipot. ortos.). Quindi la riduzione del flusso sanguigno cerebrale nella ME potrebbe essere indipendente dalla positività al tilt table test.

Simposio sulla ME/CFS a Stanford, autoanticorpi

Simposio sulla ME/CFS a Stanford, autoanticorpi

1. Introduzione

In quello che segue riporto alcune note prese durante il simposio sulla ME/CFS tenutosi a Stanford questo 12 agosto, organizzato dalla Open Medicine Foundation. Tutti gli interventi sono disponibili su youtube (R). In questo primo post parlerò esclusivamente di autoanticorpi e auspicabilmente ne seguiranno altri su altri argomenti.

autoantibodies.png
Figura 1. Sia l’università di Uppsala (sinistra) che la universita dello Utah (destra) confermano la presenza di anticorpi contro i recettori beta adrenergici e contro i recettori muscarinici della acetilcolina.

2. Anticorpi contro i recettori beta adrenergici e muscarinici della acetilcolina

In questo simposio si è avuta una conferma della presenza di anticorpi contro i recettori beta adrenergici e contro i recettori muscarinici della acetilcolina in modo significatimante maggiore nei pazienti ME/CFS, rispetto ai controlli sani (Figura 1). I dati provengono da due gruppi di ricerca distinti, quello di Alan Light (University of Utah) e quello di Jonas Bergquist (Uppsala Universitet). Il riscontro nella ME/CFS di anticorpi contro i recettori muscarinici della acetilcolina fu inizialmente riportato da un gruppo giapponese (Tanaka S et al. 2003) e recentemente da un gruppo norvegese-tedesco (Loebel M etal. 2016), il quale ha anche rilevato – per la prima volta – la presenza di anticorpi contro il recettore beta 2 adrenergico. In particolare, lo studio giapponese trovò un aumento negli anticorpi contro il recettore muscarinico M1 della acetilcolina, mentre quelo successivo evidenziò un aumento negli anticorpi contro i recettori M3 e M4 della acetilcolina (Figura 2). Vale la pena osservare che anticorpi contro i recettori adrenergici beta 1 e 2 e muscarinici M2 e M3 sono stati riscontrati anche nella ipotensione ortostatica (Yu X et al. 2012), (Li H et al. 2012), mentre gli anti-recettore adrenergico beta 2 sono stati rinvenuti nel siero di pazienti con tachicardia posturale ortostatica (Li et al. 2014). Quindi questi stessi autoanticorpi ricorrono nella intolleranza ortostatica, e la intolleranza ortostatica è un sintomo inserito nei criteri diagnostici per la ME/CFS (IOM 2015). Tutto ciò, nel complesso, sembra conferire solidità a questo dato immunitario, e suggerisce che questi autoanticorpi possano avere un ruolo causale in almeno alcuni dei sintomi di un sottogruppo di pazienti. In particolare, alcuni di questi anticorpi hanno dimostrato di interferire con la regolazione fine del diametro dei vasi sanguigni (Li H et al. 2012) e per questo potrebbero teoricamente alterare il flusso di sangue nei muscoli scheletrici e/o nel cervello.

autoantibodies 2.png
Figura 2. A sinistra lo studio del 2003, dove si riportò un aumento degli anticorpi contro il recettore muscarinico M1 della acetilcolina nella ME/CFS. A destra lo studio del 2016 in cui si riporta un aumento degli anticorpi contro i recettori muscarinici M3 e M4 della acetilcolina e contro il recettore beta 2 della adrenalina nella ME/CFS.

Non è dato sapere contro quali particolari sottotipi di recettori siano stati trovati autoanticorpi nei due nuovi studi di Light e Bergquist. Tuttavia sappiamo che Bergquist si è premurato di cercarli non solo nel sangue periferico, ma anche nel liquido spinale, trovandoli solo nel primo (figura 1).

Beta 2.png
Figura 3. Recettore beta 2 adrenergico. Si osserva l’esposizione extracellulare della coda 1-34, e dei loop 96-106, 175-196, 299-305.

3. Mimetismo molecolare

Non sappiamo perché si generino questi autoanticorpi, ma Light suggerisce che un possibile meccanismo sia rappresentato dal così detto mimetismo molecolare: il sistema immunitario produce un anticorpo contro una proteina di un patogeno – durante una infezione –  ma questa proteina assomiglia a una molecola umana e così – per errore – l’anticorpo si lega all’antigene umano, anche dopo che l’infezione è scomparsa. Questo meccanismo è ritenuto alla base della sindrome di Guillian-Barré a seguito di infezione da Campylobacter jejuni (Van den Berg B et al. 2014). Se consideriamo in particolare il recettore adrenergico beta 2, le regioni che possono essere bersaglio di anticorpi patogenetici sono quelle che dalla membrana cellulare si proiettano verso lo spazio extracellulare (figura 3), ovvero le quattro sequenze di amminoacidi 1-34, 96-106, 175-196, 299-305. Il lettore può verificare da solo, usando il software BLAST offerto dal National Centre for Biotecnology Information (R) che il peptide 2-12 del recettore è simile al peptide 67-77 della proteina sensor histidine kinase MtrB del batterio Pseudonocardia sp. Ae331_Ps2 (R) (figura 4). Questo potrebbe voler dire che – in linea del tutto teorica – un contatto del sistema immunitario con questo batterio potrebbe portare allo sviluppo di anticorpi contro il recettore adrenergico beta 2. Questo è solo un esempio che ho voluto mostrare, per far capire in pratica cosa si intenda per mimetismo molecolare.

molecular mimicry.PNG
Figura 4. Inserendo come query sequence alternativamente i peptidi 1-34, 96-106, 175-196, 299-305 del recettore adrenergico beta 2 in BLAST di NCBI, usando l’algoritmo Quick BLASTP e impostazioni di default (E=100, word di 6 lettere, BLOSUM62 come matrice di sostituzione) si ottiene come unico risultato l’allineamento fra il peptide 2-12 del recettore umano e il peptide 67-77 della proteina sensor histidine kinase MtrB di Pseudonocardia sp. Ae331_Ps2.

4. Non tutti i test sono uguali

E’ importante notare che la misura di anticorpi contro proteine di mebrana (come i recettori) deve essere effettuata incubando il siero dei pazienti con proteine che siano espresse da cellule nella loro posizione fisiologica (cell based assay, CBA). Con l’altra tipologia di test, in cui la proteina è incollata a una piastra, si rischiano tanto falsi positivi (perché la proteina espone al siero regioni che normalmente sarebbero coperte) che falsi negativi (perché la proteina è denaturata e la sua conformazione 3D è alterata). Il vantaggio di un CBA sui test tradizionali è stato dimostrato chiaramente nel caso degli anticorpi anti-MOG (Ramanathan S et al 2016). Bisogna dire che mentre lo studio norvegese-tedesco ha usato la metodologia corretta, quello giapponese del 2003 usò l’altra metodologia e questo forse rende conto della discrepanza dei risultati (figura 2). Non sappiamo che tipo di test abbiano usato Light e Bergquist.

ADRB2_2R4R_231_242
Figura 5. Modello 3D parziale del recettore beta 2 adrenergico (PDB ID: 2R4R, chain A). E’ indicata la posizione relativa alla membrana plasmatica e il peptide 231-242 individuato come possibile epitopo da DiscoTope 2.0. Si vede come questo epitopo è completamente immerso nel citoplasma e quindi non raggiungibile da autoanticorpi in condizioni fisiologiche.

5. Esperimento in silico

Il software DiscoTope 2.0 permette di prevedere tutti i possibili di una proteina contro i quali vengono prodotti anticorpi (regioni dette epitopi). La predizione viene fatta sulla base sia delle caratteristiche geometriche della proteina, che di considerazioni statistiche sulla composizione e topologia degli epitopi noti fino ad oggi (Kringelum, et al., 2012). Se consideriamo in paricolare il recettore beta 2 adrenergico, utilizzando il modello 3D ottenuto sperimentalmente nel 2007 (Rasmussen et al. 2007) e lo sottoponiamo al software DiscoTope 2.0, si ottiene come unico possibile epitopo il peptide 231-241, il quale tuttavia si trova immerso nel citoplasma (figura 5) e quindi, in condizioni fisiologiche, non potrebbe mai costituire un bersaglio per anticorpi. Tuttavia, in un test di tipo ELISA in cui il recettore beta 2 adrenergico è incollato a una piastra e viene esposto al siero, si potrebbero verificare dei falsi positivi dovuti alla reazione del siero dei pazienti contro l’epitopo 231-241.

 

Dr. Byron Hyde

Dr. Byron Hyde

In questa playlist ho raccolto una serie di brevi interviste al dr. Byron Hyde, un medico canadese che si occupa di ME/CFS da molti anni,  il quale ha sviluppato una teoria secondo la quale la ME sarebbe una infezione del cervello da parte di un enterovirus. Hyde ha un approccio e delle idee molto personali, e la sua particolarità deriva anche dal fatto che nasce come chimico, ed è diventato medico solo in un secondo momento. La diagnosi di ME per lui si basa sull’uso della SPECT, e sulla rilevazione di uno specifico tipo di danno neurologico. Bisogna dire che l’idea di una infezione da enterovirus nella ME non è del tutto priva di dati alla base (biopsie e autopsie sembrano suggerire questa ipotesi) (Chia, 2010), però non è affatto ampiamente condivisa. Resta comunque una ipotesi interessante.

Condivisibile anche la sua ricerca di patologie rare come spiegazione alternativa di alcuni casi di CFS (che distingue dalla ME), come ad esempio la sindrome di Ehlers-Danlos, oppure l’EBV cronico.