Antibodies to adrenergic and muscarinic receptors in ME/CFS

Antibodies to adrenergic and muscarinic receptors in ME/CFS

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During the Community Symposium on the molecular basis of ME/CFS (R) two different groups of researchers reported on an increased level of antibodies to beta adrenergic and muscarinic receptors in sera from ME/CFS patients vs healthy controls (Figure 1). These new data have been collected independently by Alan Light (University of Utah) and Jonas Bergquist (Uppsala Universitet). Bergquist also reported that these autoantibodies can’t be found in cerebrospinal fluid from ME/CFS patients.

Figure 1. Two slides from the symposium: on the left data from Uppsala Universitet, on the right data from a group of patients studied by Alan Light (University of Utah).

What was already known on these autoantibodies

The presence of a higher than normal reactivity of sera from ME/CFS patients to muscarinic receptors was reported for the first time by a Japanese group, more than a decade ago (Tanaka S et al. 2003) and it has been confirmed recently in a work by University of Bergen (Norway) and Charité University (Germany) (Loebel M et al. 2016). In particular, while Tanaka and colleagues measured an increased level of autoantibodies against muscarinic cholinergic receptor 1 (CHRM1) in about half of patients, the other group described an increase in reactivity of sera to subtypes M3 and M4, in a subset of patients (Figure 2). They used two completely different assays, as we will see later, and this might be the reason for the different results.

autoantibodies 2
Figure 2. An increase in reactivity of sera from ME/CFS patients to M1 cholinergic receptors was reported by Tanaka and colleagues in 2003 (left). Loebel and colleagues found an increase in reactivity to M3, M4 cholinergic receptors and beta 2 adrenergic receptors in 2016 (right).

As you can see from figure 2, the study by Loebel et al. also indicated an increase in antibodies to beta adrenergic receptors (subtype 2), in agreement with the latest data from Light and Bergquist. In this regard, it is worth noting that autoantibodies to muscarinic receptors M2 and M3, and to beta adrenergic receptors (subtype 1 and 2) have been already reported in orthostatic hypotension (OH) (Yu X et al. 2012), (Li H et al. 2012) and that antibodies to beta 2 adrenergic receptors have been identified in patients with postural-orthostatic tachycardia syndrome (POTS) (Li et al. 2014). This means that this group of autoantibodies is associated with orthostatic intolerance (POTS and/or OH), but orthostatic intollerance is part of the clinical picture of ME/CFS (IOM 2015) and those patients who have a diagnosis of POTS often have many features in common with ME/CFS patients, see for instance (Okamoto L et al. 2012), (Wise S et al. 2015). So, it might be conceivable that these autoantibodies play a role in the pathogenesis of some symptoms in a subgroup of patients, although this has not been proven, so far.

Molecular mimicry?

We don’t know the reason why the immune system of some ME/CFS patients reacts with these receptors, but Alan Light suggested, during the symposium, that a possible source for these antibodies might be a mechanism known with the name of molecular mimicry (MM). The basic idea behind MM is that B cells can erroneously produce antibodies to human proteins when epitopes of an infectious agent closely resemble epitopes found in the host (Rose NR 1998). MM is currently believed to explain the pathogenesis of Guillain-Barré syndrome, where lipo-oligosaccharides on the Campylobacter jejunii outer membrane seems to elicit (in predisposed individuals) an immune response to human gangliosides, due to the similarity between these antigens (Van den Berg B et al. 2014). Now, if molecular mimicry was involved in the origin of antibodies to beta 2 adrenergic receptors, which could be the epitope on the receptor? And which the pathogen-borne antigen? In order to provide a possible answer to this question we have to consider that the regions of a receptor that can be involved in B cell autoimmunity are only those that have extracellular exposure; the other regions are immersed in plasma membrane and in cytoplasm, so they can’t interact with antibodies. As you can see from Figure 3, beta 2 adrenergic receptor (ADRB2) has four extracellular regions, in particular peptides 1-34, 96-106, 175-196, 299-305. In general, epitopes are mainly conformational and that means that they are regions of the protein surface, produced by the folding of the protein itself. Nevertheless, in our example we will search only for linear epitopes.

Beta 2
Figure 3. Schematic representation of ADRB2, from (Rasmussen G et al. 2007). You can notice the extracellular peptides 1-34 (the N-terminus), 96-106 (loop 1), 175-196 (loop 2), 299-305 (loop 3).

I have used QuickBLASTP provided by NCBI, with default settings (E=100, a word of 6 letters, BLOSUM62 as substitution matrix) and I have considered for each of the four extracellular peptides both the sequence of residues from the N-terminus to the C-terminus, and the inverted sequence. We obtain as the only match the protein sensor histidine kinase MtrB belonging to Pseudonocardia sp. Ae331_Ps2 (R) (Figure 4). I can’t find this particular protein in UniProt, but if it was a membrane protein and if peptide 67-77 was exposed to the extracellular space, this peptide could perhaps be a candidate as a trigger for anti-ADRB2, according to the MM theory. It is important to note here that although molecular mimicry is a popular theory (perhaps because of its simplicity) it has been proven to be a cause of autoimmnity only in Guillain-Barré syndrome.

molecular mimicry
Figure 4. Peptide 2-12 of the ADRB2 receptor resembles peptide 67-77 of sensor histidine kinase MtrB (from Pseudonocardia sp. Ae331_Ps2).

So, what about a test for these autoantibodies?

If antibodies to adrenergic and muscarinc receptors were involved in the pathogenesis of some cases of ME/CFS, it would be interesting for patients to test for them. In this regard, it is worth noting that the measure of antibodies to membrane receptors should be done using an assay in which these receptors are expressed by living cells in their physiological position (CBA, cell based assay). In fact, with assays in which receptors are coated on plates we may have both false positives (due to the fact that sera react with peptides that are not in the extracellular domain) and false negatives (due to protein denaturation, which leads to the formation of epitopes that would not be present if the protein were correctly folded). The superiority of CBA over the other kind of test is well accepted in the case of anti-MOG antibodies (Ramanathan S et al 2016). It is worth noting that the study by Loebel et al. used a CBA, while the previous one (Tanaka et al.) used recombinat proteins coated on plates, and this could be the reason for the discrepancy between the results of the two studies (figure 2). As far as I know, there are no commercial CBA assays for anti-muscarinic cholinergic receptors and beta adrenergic receptors, at present. The only assay available does not seem to be a CBA, from the provided documentation (R).

Figure 5. I have reported in yellow the epitope predicted by DiscoTope 2.0 on the 3D structure of ADRB2 (PDB ID: 2R4R chain A). I have also indicated what part of the molecule is outside the cell, what is inside the membrane and what is inside the cell.

In silico experiment

We will now try to simulate what could happen with a test for the search of anti-ADB2R antibodies, if the protein was coated on a plate. We will use the prediction of DiscoTope 2.0, which is a software that calculates all possible B cell epitopes of a given protein, using both the geometry of the protein (in particular a parameter called protrusion index, calculated from the protein’s ellipsoid of inertia) and statistical data on known B cell epitopes (Kringelum, et al., 2012). If we use the 3D structure of ADB2R experimentally determined in (Rasmussen et al. 2007) with standard settings, DiscoTope predicts peptide 231-242 as the only possible epitope (consider that the experimental 3D structure of ADB2R is incomplete). As you can see from figure 5 this peptide belongs to the intracellular domain of the receptor and so it by no means could be a B cell epitope, in vivo. In conclusion, according to this simulation, there is a risk of false positive results with any test that uses recombinat ADB2R coated on a plate.



I dati grezzi dello studio Hanson

I dati grezzi dello studio Hanson


Il gruppo di Maureen Hanson (Cornell University) ha pubblicato alcuni mesi fa uno studio in cui 361 metaboliti sono stati quantificati nel sangue di 17 donne con ME/CFS (e 15 controlli sani, corrispondenti per sesso ed età) (Germain A et al. 2017). La tecnica utilizzata è la spettroscopia di massa, e questo studio si aggiunge ad altri 3 lavori analoghi sulla ME/CFS pubblicati in questi ultimi 11 mesi (Naviaux R et al. 2016), (Øystein Fluge .et al. 2017), (Yamano E et al. 2016). Lo studio Hanson e lo studio Naviaux sono per ora i due con il maggior numero di metaboliti esaminati e i loro risultati sono coerenti con un complessivo ipometabolismo: circa l’85% dei metaboliti esaminati nei due studi sono ridotti in modo significativo rispetto al controllo sano. I percorsi metabolici coinvolti sono numerosi, dalla ossidazione degli acidi grassi (beta-ossidazione), alla ossidazione degli amminoacidi, alla sintesi di fosfolipidi (i componenti delle membrane cellulari). In figura 1 trovate un confronto fra lo studio Naviaux e lo studio Hanson con analogie e differenze.

Hanson vs Naviaux.png
Figura 1. Confronto fra lo studio Naviaux e lo studio Hanson, mostrato dalla stessa Hanson durante un webinar.

I dati grezzi

In questo post non esaminerò lo studio Hanson nel dettaglio, piuttosto voglio proporre una rianalisi statistica di una piccola parte dei dati grezzi, ovvero della misura dei 361 metaboliti nelle 32 persone complessivamente esaminate. I dati sono stati resi disponibili al pubblico (cosa lodevole) in formato .XLSX. Il file è qui.

Figura 2. Riduzione significativa di oxaloacetato e succinato nei pazienti ME/CFS rispetto ai controlli sani. L’analisi statistica e i grafici delle distribuzioni sono di Paolo Maccallini.

La mia rianalisi statistica della glicolisi e del ciclo di Krebs

Per la mia analisi statistica dei dati grezzi mi sono concentrato sui percorsi metabolici della glicolisi (piruvato, lattato) e del ciclo di Krebs (aconitato, succinato, fumarato, oxaloacetato). L’analisi si basa sulla assunzione di una distribuzione normale dei valori, utilizzanto il t-test (one-tailed) per il calcolo del valore p. I valori p e le distribuzioni dei dati sono riportati in figura 2. Come si vede, c’è una tendenza all’aumento dei prodotti finali della glicolisi in alcuni pazienti (piruvato, lattato) che tuttavia non è significativa nel complesso. Si apprezza altresì una tendenza alla riduzione dei metaboliti intermedi del ciclo di Krebs, ma solo il succinato e l’oxaloacetato sono ridotti in modo significativo. E’ interessante notare che una tendenza alla riduzione dei metaboliti del ciclo di Krebs è coerente con quanto riportato in (Yamano E et al. 2016) con una metodica simile, e quanto riportato in questo blog, utilizzando la spettroscopia di massa su urine in tre pazienti, due maschi e una femmina (vedi qui).

Il test diagnostico per la ME/CFS?

Il test diagnostico per la ME/CFS?

Quella che segue è una sintesi estrema di una intervista a Ronald Davis (del 15 giugno) che potete ascoltare qui.

Un piccolo apparecchio (detto nano-needle) permette di ricondurre la misura del metabolismo di una coltura cellulare a una misura di impedenza (l’equivalente, nei conduttori sottoposti a corrente alternata, della resistenza elettrica). Se si prendono le cellule dei pazienti ME/CFS e le si espone a uno stress osmotico (aggiungendo NaCl), l’impedenza sale in modo anomalo: con cellule di persone sane non si ha aumento di impedenza.

Questo apparato sperimentale – secondo Davis – costituisce il test diagnostico per la malattia. Economico, semplice e sensibile. La specificità rispetto ad altre malattie al momento non sembra nota.

La malattia si profilerebbe come un disordine del metabolismo indotto dal sistema immunitario (cellule B e/o cellule T).

Nano-needle ha un costo irrisorio, ma richiede il collegamento a un altro apparecchio (basta un iPhone) per fornire la misura.

Citochine, TGF β 1 e ME/CFS

Citochine, TGF β 1 e ME/CFS


Quattro pazienti con diagnosi di ME/CFS e durata di malattia superiore ai 3 anni si sono sottoposti alla misura di un set di 9 citochine presso un laboratorio ospedaliero italiano. Tutti loro presentano un livello elevato di TGF β1, in accordo con due studi precedenti. Dopo aver riassunto i risultati di un precedente studio sui livelli di 51 citochine nel sangue di pazienti ME/CFS e averli confrontati con i risultati di questa piccola indagine, discuto il possibile ruolo del TGF β1 nella ME/CFS, dalla sua funzione inibitoria della citotossicità delle cellule NK, al suo valore quale indice di danno cerebrale, al suo possibile ruolo nella disfunzione della matrice extracellulare.


Negli anni sono stati condotti numerosi studi sul livello di citochine nel sangue periferico e nel liquido spinale dei pazienti ME/CFS, con risultati contraddittori. Nel 2015, alcuni dei maggiori esperti di questa patologia (tra cui Hornig, Lipkin, Montoya, Komaroff, e Peterson) hanno pubblicato un lavoro sulla misura di 51 citochine in 298 pazienti e in 348 controlli sani (sangue periferico). I pazienti sono stati divisi in un gruppo di 52 persone con una malattia di durata minore o uguale a 3 anni e in un altro gruppo (246 pazienti) con una malattia di durata maggiore di 3 anni. I ricercatori hanno riscontrato uno stato di attivazione immunitaria nel primo gruppo, e di esaurimento immunitario nel secondo (Hornig M et al. 2015). In questo studio, il gruppo di controllo è stato costruito tenendo conto non solo dell’età e del sesso, ma anche della collocazione geografica e della stagione al momento del prelievo di sangue. Poiché oggi sappiamo che più di 4000 geni immunitari vengono espressi con un livello che oscilla in funzione della stagione e della latitudine (Dopico XC et al. 2014), la precauzione di tenere in conto anche latitudine e stagione è indice di qualità dello studio. Per questo motivo, per la dimensione dei gruppi di persone esaminate, e per la varietà di citochine misurate, tendo a considerare il lavoro di Hornig e colleghi come il punto di riferimento, quando si tratta di citochine nella ME/CFS.

Nove citochine e quattro pazienti

Prima di riassumere i risultati dello studio Hornig, riporto la misura di 9 citochine in quattro pazienti ME/CFS italiani (3 maschi e una femmina) con durata di malattia superiore ai 3 anni (vedi tabella 1). Come indicazione della gravità della patologia, per ogni paziente è indicato il livello di abilità della scala del dr. Bell, che si può trovare in italiano in questa pagina. Questa selezione di citochine è stata effettuata lo scorso febbraio da me e da un altro paziente, scegliendo i parametri immunitari dello studio Hornig disponibili presso il laboratorio analisi dell’ospedale di Padova. Nella prima colonna si trovano i nomi delle citochine analizzate e affianco un simbolo in parentesi quadra il cui significato è secondo quanto segue: [<] indica una riduzione del metabolita nel sangue dei pazienti dello studio Hornig rispetto al controllo sano, associata a un valore p<0.05; il simbolo [<<] indica una riduzione associata a un valore p<0.01; il simbolo [=] indica che non c’è differenza tra malati e controllo sano. Il parametro TGF β1 non è stato misurato, come vedremo, nello studio Hornig.  Questo è un peccato, perché il valore di TGF β1 è l’unico ad essere alterato (aumentato) in ciascuno dei 4 pazienti. Specifico che poiché i pazienti qui riportati hanno una durata di malattia maggiore di 3 anni, i dati dello studio Hornig considerati sono solo quelli del gruppo di pazienti con una durata di malattia superiore ai 3 anni.

P1 (M, 37)  P2 (F, 49) P3 (M, 43) P4 (M, 27) rif (ng/l)
INF γ                     [<] <2.0 <2.0 <2.0  3.2 [0.0 – 15.6]
IL 1α                      [=] <2.0 <2.0 <2.0 <2.0 [0.0 – 3.9]
IL 1β                      [<] <5.0 <5.0 <5.0  <5.0 [0.0 – 5.0]
IL 2                        [=] <9.9  13.8 <9.9  <9.9 [0.0 – 9.9]
IL 4                        [=] <1.3 <1.3 <1.3  <1.3 [0.0 – 1.3]
IL 6                      [<<] <2.0 <2.0 <2.0  <2.0 [0.0 – 5.9]
IL 8                        [=] 7 6 <5 6 [0.0 – 62.0]
TGF β1                  [?] 58.1 77.4  48.6  70.9 [6.0 – 34.0]
TNFα                     [=] 10.7 6.7  – 5.3 [0.0 – 8.1]
Scala di Bell 20-30 20-30 40 20-30 [0 – 100]

Tabella 1. Misura di nove citochine in 4 pazienti ME/CFS con malattia di durata superiore ai 3 anni. Le misure sono state effettuate presso l’ospedale di Padova. E’ indicato il sesso, l’età e il valore della scala di Bell dei quattro pazienti (P1, 2, 3, 4). Sono evidenziati i valori fuori norma.

Cinquantuno citochine e 298 pazienti

Vediamo ora nel dettaglio i risultati dello studio Hornig. Come si vede in figura 1, delle 51 citochine misurate nel sangue, solo 24 presentano una differenza significativa fra i gruppi di malati (di breve e lunga durata) e il controllo sano (vedi figura 1). In rosso ho evidenziato quali tra queste 24 sono state misurate anche nei nostri 4 pazienti.

Figura 1. Le 24 citochine dello studio Hornig in cui si riscontrano differenze significative tra pazienti di breve durata (blu), pazienti di lunga durata (rosso) e controlli (grigio). Nei riquadri rossi le citochine misurare anche nei nostri quattro pazienti (tabella). Queste citochine sono tutte proinfiammatorie, ad eccezione delle quattro nel riquadro nero (anti infiammatorie). * indica un valore p < 0.05, ** sta per p < 0.01, *** sta per p < 0.001, **** sta per p < 0.0001.

Lo studio non evidenzia differenze significative tra controlli e malati, a meno che non si dividano i malati in due gruppi: un gruppo in cui la malattia dura meno di tre anni e uno in cui la durata è superiore ai tre anni. Non appena si faccia questa distinzione, i pazienti di breve durata risultano in uno stato di attivazione immunitaria (citochine elevate), mentre quelli di lunga durata sembrano in una condizione di esaurimento immunitario (citochine ridotte), sia nel ramo proinfiammatorio, che in quello anti infiammatorio. Gli autori hanno ipotizzato che l’esaurimento immunitario possa essere una conseguenza della attivazione immunitaria che si verifica nei primi tre anni di malattia, coerentemente con quanto descritto per le cellule T CD8 durante infezioni croniche (Utzschneider DT et al. 2013). Per quanto riguarda i nostri 4 pazienti, le citochine INFγ, IL 1α, IL 6, e IL 8 si trovano nella parte bassa dell’ambito di normalità e quindi potremmo ritenere questi valori coerenti con quanto rilevato da Hornig e colleghi. Tuttavia, il paziente uno presenta un valore alto di TNFα. Questa citochina proinfiammatoria ha molteplici funzioni (vedi tabella 2) e il suo livello è elevato nella fase attiva del Lupus (Umare V et al. 2014) e della artrite reumatoide (Wendling D et al. 2015).

TNF-α Macrofago, neutrofilo, cellula Th1 Macrofago Stimola la sintesi di IL-12
Natural Killer Stimola la sintesi di IFN-γ
Parete dei vasi Induce la sintesi di SEL
Cell. Dendritica Viene attivata

Tabella 2. Alcune funzioni del TNF alpha. Nella seconda colonna le cellule che lo sintetizzano, nella terza le cellule bersaglio, nella quarta le funzioni espletate.

TGF beta

Il riscontro più interessante delle misure fatte sui 4 pazienti della tabella 1 è che tutti presentano un valore elevato di transforming growth factor beta 1 (TGF β1). Il TGF β viene sintetizzato in una forma inattiva che richiede l’intervento di un enzima proteolitico per trasformarsi nella sua forma attiva (Whal SM 2007) che è coinvolta nella proliferazione cellulare, nella risposta immunitaria/infiammazione, nella embriogenesi, nella integrità vascolare e nel rimodellamento della matrice extracellulare (Flavell RA et al. 2010), (Lafyastis R 2014).

Livello del TGF β nella ME/CFS

Il TGF β è presente in quattro isoforme, TGF β 1, 2, 3, 4 e lo studio Hornig ne ha misurato il livello complessivo. Questo livello è normale nei pazienti presi nel loro complesso, mentre risulta addirittura ridotto se si considerano solo i pazienti di lunga data (Tabella S6). Un risultato analogo è stato appena riportato in uno studio su 50 pazienti ME/CFS e 50 controlli, condotto dallo stesso gruppo di ricerca (Nagy-Szakal D et al. 2017), vedi TabellaS4. Esistono poi diversi studi precedenti (vedi tabella 3) dei quali tre (di cui due su soli 10 pazienti) hanno riportato un incremento del TGF beta (Chao CC et al. 1991), (Peterson D et al. 1994), (Bennett AL et al. 1997). Potremmo dunque assumere che effettivamente il livello complessivo di TGF β 1, 2, 3, 4 sia normale nella ME/CFS. Ma cosa si può dire della isoforma 1? Esistono almeno due studi (tabella 4) che hanno misurato esclusivamente questa isoforma in complessivi 56 pazienti e 43 controlli, riportandone un aumento del livello nel sangue periferico dei pazienti (Kennedy G et al. 2004), (White PD et al. 2004). Ciò è in accordo con quanto misurato nei nostri 4 pazienti (tabella 1). E’ possibile che mentre il livello del TGF β 1 aumenta, il livello complessivo delle isoforme del TGF β rimanga normale o addirittura si riduca? Credo che altri studi dovrebbero elucidare questo aspetto.

 Fonte Casi/
Livello del TGF β Campione
(Nagy-Szakal D et al. 2017) 50/50 nessuna differenza siero
(Hornig M et al. 2015) 298/348 nessuna differenza siero
(Bennett AL et al. 1997) 93/80 aumentato nei casi (p<0.01) siero
(MacDonald KL et al. 1996) 47/47 nessuna differenza siero
(Swanink C et al. 1996) 76/69 nessuna differenza siero
(Peterson D et al. 1994) 10/10 aumentato nei casi (p<0.01) siero
(Chao CC et al. 1991) 10/10 aumentato nei casi (p<0.01) siero

Tabella 3. Studi che hanno indagato il livello del TGF β (siero) nei pazienti ME/CFS.

 Fonte Casi/
Livello del TGF β 1
(White PD et al. 2004) 9/9 aumentato nei casi (p<0.001) siero/plasma
(Kennedy G et al. 2004) 47/34 aumentato nei casi (p=0.005) plasma

Tabella 4. Studi che hanno indagato il livello del TGF β 1 nei pazienti ME/CFS.

TGF β1 e NK

Di particolare interesse nel nostro caso è il ruolo che il TGF β1 gioca nella regolazione e soppressione della citotossicità delle cellule NK (Bellone G et al. 1995), essendo questo parametro ridotto nella ME/CFS (Caligiuri et al, 1987), (Maher et al, 2005), (Strayer et al, 2015), (Nguyen T et al. 2016). Quindi un aumento del TGF β1 potrebbe forse essere una delle cause della ridotta citotossicità delle NK nella ME/CFS.

TGF β1 e cervello

La sintesi cerebrale di TGF β1 aumenta a seguito di danno al  sistema nervoso centrale: ad esempio il livello sierico di TGF β1 risulta aumentato nella malattia di Alzheimer (Chao CC, et al. 1994) e nella retinopatia diabetica in pazienti con diabete di tipo I (Zorena K et al. 2013). Nel complesso si ritiene che TGF β1 eserciti una azione neuroprotettiva e sia un indice di danno neurologico, ma si è ipotizzato anche che la stessa molecola eserciti una azione detrimentale nei confronti della vasculatura cerebrale (Rustenhoven, J et al. 2016).

TGF β e matrice extracellulare

Altro aspetto di interesse è la interazione fra il TGF β e la matrice extracellulare, in particolare la fibrillina: la fibrillina sembra sequestrare il TGF β (Wipff J et al 2009), tanto che un difetto nella fibrillina (come nella sindrome di Marfan) è associato a un aumento del TGF β nel sangue (Robinson BN et al. 2005). Una possibilità è dunque che un difetto nella matrice extracellulare dei pazienti ME/CFS sia la causa dell’aumento del TGF β1. Ma perché si dovrebbe sospettare un difetto di questo tipo nella ME/CFS? La matrice extracellulare sembra implicata perché in questi pazienti esiste una prevalenza insolitamente elevata di casi di ipermobilità (vedi qui). Da notare a tal proposito che la paziente con il livello più elevato di TGF β1 del nostro studio (tabella 1) presenta un sospetto di EDS III (una malattia genetica della matrice extracellulare). I pazienti con EDS di tipo vascolare (un’altra forma di EDS) presentano valori elevati di TGF β1, che si ipotizza possano essere una conseguenza del danno vascolare di questi pazienti (Morisette R et al. 2014). Anche questo dato desta interesse, non appena si considera che nella ME/CFS è stata descritta una disfunzione endoteliale nelle grandi e piccole arterie (Newton DJ et al. 2011). Il livello elevato di TGF β potrebbe dunque anche essere una conseguenza di questa anormalità.


La misura di un pannello di 9 citochine nel sangue di 4 pazienti ME/CFS con durata di malattia superiore ai tre anni ha permesso di rilevare un aumento del valore del TGF β1 in ciascuno di essi, in accordo con due studi precedenti. Il significato di questa alterazione immunitaria nella ME/CFS (ammesso ve ne sia uno) non è chiaro, ma potrebbe essere legato alla ridotta citotossicità delle NK, a danni neurologici, a difetti nella matrice extracellulare, o ad anormalità nei vasi sanguigni.

Mitocondri norvegesi, terzo atto: qualcosa nel sangue

Mitocondri norvegesi, terzo atto: qualcosa nel sangue

Per una lettura veloce andare direttamente ai paragrafi 7 e 8.


Nei precedenti due articoli (qui e qui) sul lavoro pubblicato da Fluge, Mella e collaboratori (Fluge et al. 2016) abbiamo visto che:

  • qualcosa induce l’espressione di una serie di meccanismi che riducono la funzione del piruvato deidrogenasi, costringendo i pazienti ME/CFS a bruciare amminoacidi al posto dello zucchero. Ma dei sistemi di compenso intervengono per cercare di riportare il metabolismo energetico alla normalità, senza riuscirci. I sistemi di compenso sono diversi fra maschi e femmine, ma il difetto metabolico a monte è lo stesso nei due sessi.

All scopo di individuare la molecola (o le molecole) a cui ricondurre l’origine di questa disfunzione, il gruppo di scienziati ha preparato delle colture di cellule umane provenienti da muscoli scheletrici, e le ha esposte al siero di 12 pazienti ME/CFS e di altrettanti controlli sani. Le colture cellulari sono state poi sotToposte a due tipi di misure:

  1. il livello di consumo di ossigeno (OCR, oxygen consumption rate), che indica il livello di attività dei mitocondri;
  2. il livello di acidificazione dello spazio extracellulare (ECAR, extracellular acidification rate) che è una misura surrogata del livello di acido lattico prodotto.

Entrambi i parametri sono stati misurati sia in presenza di glucosio, che in presenza di amminoacidi. Nel complesso sono state fatte misure in quattro condizioni sperimentali.

2.Primi due esperimenti: amminoacidi e glucosio

Le cellule muscolari a riposo – esposte al siero dei pazienti – e coltivate in presenza di amminoacidi, presentano un consumo di ossigeno maggiore delle cellule esposte al siero di controlli sani (figura1, B.I). Aggiungendo il glucosio (figura 1, B.II), la situazione non cambia: ancora la respirazione delle cellule muscolari esposte al siero dei pazienti è maggiore di quella delle cellule muscolari esposte al siero di controlli sani. La sintesi di acido lattico non differisce fra le cellule esposte a siero di pazienti e cellule esposte a siero di controlli sani (figura 1, D.I e D.II).

coltura celulare 2.jpg
Figura 1. Consumo di ossigeno e nei quattro esperimenti (B) e sintesi di acido lattico (D).

3.Terzo esperimento: blocco dell’enzima ATP sintasi

Il blocco dell’enzima ATP sintasi, il quale si occupa di convertire ADP in ATP alla fine della catena respiratoria, riduce drammaticamente il consumo di ossigeno in entrambe le colture, ma quella con siero di pazienti è meno colpita (figura 1, B.III). Vale la pena ricordare che la subunità beta dell’enzima ATP sintasi è sovra espressa nei pazienti ME/CFS (vedi qui), e questo potrebbe essere legato all’effetto benefico del siero dei pazienti in questo esperimento. La produzione di lattato in questo esperimento è maggiore nelle cellule esposte a siero di pazienti (figura 1, D.III).

4.Quarto esperimento: blocco della catena respiratoria

I ricercatori hanno esposto le colture cellulari a una molecola (la CCCP) che inibisce la catena respiratoria. Come forma di compenso le colture cellulari aumentano drasticamente il consumo di ossigeno ma la coltura esposta al siero ME/CFS consuma più ossigeno (figura 1, B.IV) e produce più lattato (figura 1, D.IV).

coltura celulare 3.jpg
Figura 2. Sottrazioni fra misure effettuate negli esperimenti su coltura cellulare.


I ricercatori hanno poi effettuato i seguenti calcloli, i cui risltati sono riportati in figura 2:

  • consumo di ossigeno dell’esperimento II meno quello dell’esperimento III (figura 2, E);
  • consumo di ossigeno dell’esperimento IV meno quello dell’esperimento III (figura 2, E);
  • produzione di acido lattico dell’esperimento II meno quello dell’esperimento I (figura 2, F);
  • produzione di acido lattico dell’esperimento III meno quello dell’esperimento II (figura 2, F);
  • produzione di acido lattico dell’esperimento IV meno quello dell’esperimento II (figura 2, F).

6.Cosa ci dicono questi esperimenti?

Non è immediato dedurre il significato di questi esperimenti, almeno per me. Tuttavia possiamo dire quanto segue.

  • Il consumo di ossigeno delle cellule muscolari esposte al siero dei pazienti è maggiore di quello del gruppo di controllo (esperimenti I-IV), e questo è apparentemente in disaccordo con quanto risulta dai test ergosirometrici nella ME/CFS, in cui il consumo di ossigeno sistemico – per watt erogato – è minore nei pazienti (Vanness, 2007), (Snell, 2013).
  • Stressando chimicamente la catena respiratoria (esperimenti III e IV) la produzione di acido lattico aumenta nella coltura esposta a siero di pazienti più di quanto non aumenti nel contollo. Forse questo è il dato più interessante, che potrebbe rispecchiare un blocco nel piruvato deidrogenasi indotto dal siero dei pazienti nella coltura cellulare.


Gli esperimenti in vitro di Fluge e colleghi dimostrano che nel siero dei pazienti ME/CFS è presente un fattore X (non noto) che:

  1. aumenta la capacità delle cellule di consumare ossigeno;
  2. aumenta la produzione di lattato in condizioni di aumentato fabbisogno energetico (simulate in provetta con inibitori della catena respiratoria).

La prima osservazione può indicare – secondo gli autori – la presenza di meccanismi di compenso attivati da messaggeri chimici contenuti nel sangue dei pazienti, che potenziano l’attività mitocondriale. La seconda osservazione sperimentale è in accordo con lo studio di Armstrong, che non rileva un aumento del lattato basale (Armstrong CW et al. 2015), e con osservazioni del gruppo norvegese (non ancora pubblicate) che indicano un aumento significatico di lattato dopo esercizio, rispetto ai controlli sani. L’aumento di lattato a seguito di esercizio è ciò che ci si aspetterebbe in presenza di un blocco del piruvato deidrogenasi. Quindi il fattore X (o i fattori?) contenuto nel siero dei pazienti è responsabile di due azioni, apparentemente opposte: da un lato potenzia i mitocondri, dall’altro fa aumentare la produzione di lattato. Questo potrebbe voler dire che:

  • nel siero dei pazienti è presente sia la causa dell’inibizione del piruvato deidrogenasi, che un fattore di compenso, che cerca di porre rimedio al difetto metabolico.

Questa è solo una delle interpretazioni possibili, ovviamente. Aggiungo che un aumento significativo del lattato dopo attività fisiche blande era stato segnalato in un precedente studio su un solo paziente, realizzato dal paziente stesso (Mark Vink 2015).

8.Un possibile test

Come abbiamo visto, nella ME/CFS il lattato basale sembra normale (Armstrong CW et al. 2015) e lo studio di Fluge e Mella – qui discusso – conferma questa dinamica anche con esperimenti in vitro. Tuttavia, a seguito di stress energetici, la produzione di lattato aumenta più di quanto ci si aspetterebbe normalmente, come già dimostrato da un paziente/ricercatore (Mark Vink 2015) e come evidenziato anche nello studio di Fluge e Mella, in vitro. Allora ho pensato che un possibile test in grado di rilevare questa dinamica metabolica potrebbe essere la misura di lattato e ammonio nel test da sforzo ischemico dell’avambraccio. In questo test viene fatta contrarre ripetutamente una mano del paziente (con una pallina morbida), essendo il flusso sanguigno bloccato con laccio emostatico. Dopo l’esercizio (che dura un minuto), diversi prelievi venosi vengono fatti nei successivi 10 minuti, con il laccio ancora stretto. Questi prelievi forniscono la produzione locale di lattato da parte dei muscoli scheletrici (Livingstone C et al. 2001). In figura 3 potete vedere l’esame di un paziente: il livello basale di lattato è perfettamente nella media, ma dopo 3 minuti la curva (in rosso) si discosta dal valore medio e sale oltre il valore massimo (anche se di poco). Questo tipo di andamento è coerente con quanto evidenziato in vitro da Fluge e Mella, e con la loro ipotesi sul piruvato deidrogenasi.

Figura 3. Curva lattato, dopo sforzo ischemico dell’avambraccio. In rosso il livello di acido lattico del paziente, che da un valore perfettamente normale, sale superando il valore massimo (anche se di poco).

In questo test si misura anche l’ammonio, come verifica del fatto che il paziente si sia ‘impegnato’ nell’esecuzione dello sforzo. Infatti l’ammonio è un prodotto del metabolismo energetico (specialmente anaerobico), secondo le seguenti reazioni:

  1. 2ADP –> ATP + AMP
  2.   AMP –> IMP + NH3

9.Il cavaluccio marino

Le misure di cui ho parlato in questo articolo sono state effettuate con il dispositivo Seahorse XFe96 della Agilent. Questo apparecchio permette di misurare in tempo reale il metabolismo energetico cellulare (ad esempio di linfociti) attraverso una misura del consumo di ossigeno (che fornisce una stima semplice del funzionamento mitocondriale) e la produzione di protoni (che si può ritenere una misura della glicolisi), in varie condizioni sprimentali. Video esplicativo.

Mitocondri norvegesi, secondo atto: espressione genica

Mitocondri norvegesi, secondo atto: espressione genica

Per una sintesi si rimanda all’ultimo paragrafo.


Nel mio precedente articolo sullo studio pubblicato dal gruppo di Fluge e Mella, mi sono limitato a riportare i loro risultati sulla analisi dei 20 amminoacidi standard nel sangue dei pazienti ME/CFS. Riassumendo:

  • nelle donne con ME/CFS gli amminoacidi che si trasformano in acetil-CoA e quelli che alimentano direttamente il ciclo dell’acido citrico (ciclo TCA) sono ridotti;
  • nei maschi non si ha questa riduzione degli amminoacidi nel sangue, ma si ha un aumento della 3-metilistidina  (3-MHis), che suggerisce che i muscoli vengono smembrati (catabolizzati) per alimentare il ciclo del TCA. Nelle donne questo fenomeno è assente.

Gli autori hanno formulato allora la seguente ipotesi:

  • i pazienti ME/CFS (sia maschi che femmine) utilizzano gli amminoacidi per alimentare i mitocondri (il ciclo del TCA avviene dentro i mitocondri) più di quanto facciano i controlli sani.

I mitocondri – in condizioni normali –  usano come fonte principale di alimentazione lo zucchero. Lo zucchero – trasformato in piruvato fuori dai mitocondri (nella glicolisi) – viene ulteriormente trasformato in acetil-CoA dal PDH, e quindi alimenta il ciclo del TCA (vedi figura 1).

Figura 1. Rappresentazione semplificata del metabolismo energetico. Lo zucchero è trasformato in piruvato nella glicolisi, il piruvato è trasformato in acetil-CoA dal piruvato deidrogenasi (PDH). L’acetil-CoA entra nei mitocondri dove alimenta il ciclo del TCA. Si vedono anche i vari punti di ingresso degli amminoacidi nei percorsi metabolici.

Ciò posto, una possibile spiegazione per l’aumentato consumo degli amminoacidi da parte dei pazienti ME/CFS è che:

  • l’attività dell’enzima piruvato deidrogenasi (PDH) sia ridotta – per qualche motivo – e quindi l’approvigionamento di acetil-CoA è deficitario. In questo contesto, i mitocondri bruciano gli amminoacidi per produre energia, al posto dell zucchero.

Espressione genica

Per verificare l’ipotesi di un ridotto funzionamento del piruvato deidrogenasi (PDH), gli autori sono passati a un secondo gruppo di analisi, che sono l’oggetto del presente articolo. In particolare, il gruppo norvegese ha misurato l’RNA messaggero (l’espressione genica) di diversi geni che sono coinvolti nella regolazione della attività del PDK. L’espressione genica è stata misurata in un gruppo di cellule facilmente accessibili, ovvero le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). In pratica le PBMC sono: linfociti (cellule B, T, NK) e monociti (macrofagi). Ebbene, diversi geni coinvolti nella inibizione del piruvato deidrogenasi risultano sovra espressi, tanto nei maschi che nelle femmine con ME/CFS. Vediamo quali.

Figura 2. Gli enzimi PDK1, PDK2 e PDK 4 (riquadri rossi) sono sovraespressi nella ME/CFS.

Piruvato deidrogenasi chinasi

L’enzima piruvato deidrogenasi chinasi (PDK) ha come principale funzione quella di inibire il PDH. Dunque una buona domanda da farsi è: quanto PDK è espresso nelle cellule delle persone con ME/CFS? Se l’attività del PDH è ridotta, ci si potrebbe aspettare che l’espressione del PDK sia aumentata. In effetti questo è proprio ciò che è stato trovato. Premesso che l’enzima PDK esiste in 4 varianti negli esseri umani (PDK1, PDK2 etc), i norvegesi hanno trovato che PDK1, PDK2 e PDK4 sono sovraespressi nei pazienti ME/CFS (sia maschi che femmine), come indicato in figura 2. La maggiore differenza fra pazienti e controllo sano riguarda il PDK1 (p = 0.0018), quindi gli autori hanno indagato ulteriormente l’espressione di questo enzima, scoprendo che:

  • il PDK1 è espresso maggiormente nelle donne che negli uomini (figura 3, M);
  • il PDK1 è tanto più espresso quanto più severa è la patologia (figura 3, N);
  • il PDK1 è espresso in modo maggiore in chi è malato da più di 10 anni (figura 3, O);
  • il PDK1 è espresso maggiormente in chi compie meno di 2200 passi al giorno (figura 3, P).

In condizioni di salute, l’aumento della espressione genica dei PDK (con conseguente inibizione del PDH) si verifica durante periodi di mancanza di cibo. Quindi – in un certo senso – i pazienti ME/CFS soffrono le conseguenze della mancanza di cibo, pur vivendo nella disponibilità di risorse alimentari.

Figura 3. Livello del PDK1 in funzione del sesso dei pazienti (M), della severità della patologia (N), della durata della patolgia (O) e del numero di passi giornalieri (P).


Fluge e Mella hanno esaminato – sempre nelle PBMC – l’espressione di una serie di altri geni, tra cui i geni PPARD (Peroxisome proliferator-activated receptor) che svolgono moltissimi ruoli nella regolazione del metabolismo cellulare, tra cui la regolazione del metabolismo degli zuccheri, dei carboidrati e delle proteine (Dunning, KR et al. 2014). I PPAR sono tre, ma tra questi l’unica differenza significativa tra pazienti e controllo sano è nel PPARD, che è sovra espresso nei pazienti (vigura 4, F). E’ interessante notare che PPARD controlla l’espressione genica del PDK4: infatti agonisti del recettore PPARD aumentano l’espressione genica del PDK4, nelle cellule muscolari umane (Abbot EL et al. 2005). Questo significa che una possibile catena di eventi è questa:

  • l’aumentata espressione di PPARD aumenta a sua volta l’espressione di PDK4, che inibisce il piruvato deidrogenasi.

Tuttavia questo è solo uno dei possibili percorsi regolatori coinvolti in questo complessi fenomeni.

Figura 4. Il gene PPARD è sovraespresso.

Espressione di altri geni

Gli Autori norvegesi hanno indagato l’espressione di numerosi altri geni, trovando altre differenze fra controlli sani e pazienti. In particolare, il gene SIRT4 è sovra espresso (figura 5, K), così come il gene MPC1 e il gene per la subunità PDHA del PDH (figura 5, I e G). E’ interessante che questi tre geni siano strettamente legati fra loro, infatti la proteina codificata da SIRT4 inibisce la subunità PDHA del PDH, mentre MPC1 aumenta l’espressione genica di PDHA. Insomma, da un lato si inibisce questo pezzo del PDH e dall’altro si cerca di aumentarne il numero, per compensare!

Figura 5. SIRT4 è sovraespressa (K), così come MPC1 (I) e PDHA (G).

Norvegia vs Pisa

Ho parlato più volte dell studio sulla espressione genica nei mitocondri dei pazienti ME/CFS della Reumatologia di Pisa (vedi qui). Ricordo che nella prima parte di quello studio si verificò l’espressione genica di 194 proteine mitocondriali in due gemelli, uno sano e uno con ME/CFS. In questo caso le cellule usate sono le piastrine, non le PBMC. Confrontando questi dati con quelli dello studio norvegese si osserva quanto segue.

  • La subunità PDHA (PDH E1-alpha) è sovra espressa sia nello studio norvegese (figura 5, G) che nel gemello con ME/CFS, che ne esprime 1.6 volte di più del fratello sano (Tabella S1); il gemello malato sovraesprime anche la subunità E1 beta.
  • la PDK1 e la PDK3 sono sovraespresse nel gemello malato (1.54 volte e 1.73 volte, rispettivamente) (Tabella S1). Nello studio norvegese ad essere sovraespresse sono la PDK1, la PDK2 e la PDK4 (figura 3), quindi esiste una discrepanza fra i due risultati.

Nel complesso si riscontrano dunque sia somiglianze che incongruenze fra questi due studi.

Cosa emerge?

Riassumo i punti salienti di quanto qui visto:

  1. i mitocondri consumano amminoacidi al posto dello zucchero per produrre energia, e questo fa pensare a un possibile blocco dell’enzima piruvato deidrogensi (PDH);
  2. una serie di enzimi che inibiscono il piruvato deidrogenasi (PDK1,2,4) sono effettivamente sovra espressi nei pazienti ME/CFS, rispetto ai controlli sani;
  3. una proteina (la PPARD) che aumenta l’espressione del PDK4 è sovra espressa nei pazienti ME/CFS;
  4. la proteina SIRT4, che inibische la subunità PDHA del PDH, è sovra espressa nei pazienti ME/CFS e, come forma di compenso, la subunità PDHA è sovra espressa, probabilemnte grazie alla sovra espressione di MPC1, che ha funzione regolatoria.

Detto in termini più semplici:

  • qualcosa induce l’espressione di una serie di meccanismi che riducono la funzione del piruvato deidrogenasi, costringendo i pazienti ME/CFS a bruciare amminoacidi al posto dello zucchero. Ma dei sistemi di compenso intervengono per cercare di riportare il metabolismo energetico alla normalità, senza riuscirci. I sistemi di compenso sono diversi fra maschi e femmine, ma il difetto metabolico a monte è lo stesso nei due sessi.

In un prossimo articolo riporterò la terza parte dello studio, che ha esaminato l’effetto del sangue dei pazienti su cellule umane in coltura. In quella sede torneremo sulle conclusioni da trarre da questi dati, e da quelli di altri studi.

I dati grezzi dello studio Naviaux

I dati grezzi dello studio Naviaux

I dati grezzi

Sono state rese disponibili tutte le misure metaboliche effettuate da Naviaux e colleghi sui 45 pazienti ME/CFS (22 uomini e 23 donne) e sui controlli sani. Sono i dati utilizzati per lo studio metabolomico pubblicato ad agosto, che dimostrò un complessivo ipometabolismo, ricondotto dagli Autori a uno scarso funzionamento mitocondriale. Avevo discusso questo lavoro in un articolo del mio blog (vedi qui). I dati sono disponibili in questa pagina. Per ciascuno dei 612 metaboliti è possibile avere il valore nel sangue di ognuno dei partecipanti. Inoltre è possibile stampare dei grafici, con la distribuzione dei valori nei seguenti 4 gruppi: femmine malate, maschi malati, femmine sane, maschi sani.


Figura 1. Distribuzione dei valori di PC(16:0/16:0) nei maschi e nelle femmne, con malattia e senza. Ho aggiunto l’indicazione di valore massimo e minimo, di primo e terzo quartile e di valore mediano.

Un esempio

Se consideriamo ad esempio la molecola PC(16:0/16:0) e stampiamo il grafico, otteniamo la figura 1. In ciascuno dei quattro gruppi, i grafici ‘a scatola’ riportano:

  • il valore minimo e il valore massimo;
  • il primo quartile, sotto il quale si trova un quarto dei valori;
  • il valore mediano, sotto il quale cadono metà dei valori;
  • il terzo quartile, sotto il quale cadono 3/4 dei valori.

Questa molecola partecipa al metabolismo dei fosfolipidi e come si vede risulta ridotta nei soggetti malati, rispetto ai soggeti sani dello stesso sesso.

Naviaux vs Fluge e Mella

Proviamo ora a fare un confronto fra un metabolita presente sia nello studio Naviaux, che in quello metabolico di Fluge e Mella (discusso qui). Prendiamo la prolina, un amminoacido che nel secondo studio risulta ridotto nelle donne ME/CFS e normale nei maschi. Come si vede dalla figura 2, nello studio di Naviaux la prolina è invece normale nelle femmine ME/CFS (e anche nei maschi). E questa stessa contraddizione tra i due studi si riscontra anche in altri amminoacidi.


Figura 2. Distribuzione dei valori di prolina nei maschi e nelle femmine, con malattia e senza.